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HS-SPME/GC-MS和电子感官技术分析毛霉型豆豉发酵过程中风味品质

2020-07-01蒋立文谢艳华陈力力周红丽

核农学报 2020年7期
关键词:豆豉挥发性风味

蒋立文 谢艳华 李 跑 陈力力 周红丽 陈 怡

(1湖南农业大学食品科学技术学院,湖南 长沙 410128;2食品科学与生物技术湖南省重点实验室,湖南 长沙 410128)

豆豉是我国具有名族特色的传统发酵调味品。毛霉型豆豉在发酵过程中,在以毛霉为主及其他微生物多种酶的作用下[1],发生了碳水化合物、蛋白质和脂肪等大分子物质降解和后发酵期间复杂的分解合成等反应,产生了醇类、酯类等多种风味物质及风味成分前体物质[2-3]。不同发酵阶段的挥发性成分有差异,不同阶段挥发性成分对毛霉型豆豉香气、滋味影响较大。目前评价豆豉的品质风味仍以人为感官评价为主,该方法无法避免个人喜好等缺陷,不能客观有效地对豆豉风味品质进行评价。近年来,虽然国内外学者对豆豉进行了研究,但主要集中在豆豉风味物质[4-5]、豆豉工艺[6-9]等方面,仍然不够系统。

为了探讨不同发酵阶段毛霉型豆豉风味品质的差异,本研究对发酵过程中毛霉型豆豉风味品质变化进行了客观有效的评价,以不同发酵阶段的毛霉型豆豉为样本,采用顶空固相微萃取/气相色谱-质谱法(headspace holid phase microextraction/gas chromatograohy-mass spectrometry,HS-SPME/GC-MS)与电子感官技术相结合的方法,分析毛霉型豆豉不同发酵时期样品的挥发性成分和不同发酵样品的气味和滋味,以期为毛霉型豆豉质量控制及品质分析提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黄豆、食盐、白酒一般采购符合食品加工要求,食盐为食用盐,白酒为邵阳大曲,50 度(v/v)。原料黄豆为当地市售非转基因黄豆,

乙醚、浓硫酸、甲醇溶液(色谱纯)、正己烷(色谱纯)、无水硫酸钠(分析纯)、KOH(分析纯)、磷酸,均购自国药集团化学试剂有限公司;2-甲基戊酸,购自德国Dr.Ehrenstorfer 公司;短中链游离脂肪酸标准品(乙酸、丙酸、异丁酸、正丁酸、异戊酸、戊酸、正己酸、正庚酸、正辛酸、正癸酸)、37 种脂肪酸甲酯混标储备液、有机酸标准品(酒石酸、乳酸、苹果酸、柠檬酸、丁二酸、富马酸),均购自美国西格玛奥德里奇公司;环己酮,购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 主要仪器与设备

57330-U 固相微萃取装置(包括手柄、导向杆)SPME 进样器,上海安谱科学仪器有限公司;75 μm 聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane,PDMS)萃取头,美国SUPELCO 公司;GCMS-QP2010 型气相色谱-质谱联用仪,日本SHIMADZU(岛津)公司;PEN3 电子鼻和TS5000Z 电子舌,北京盈盛恒泰科技有限责任公司。

1.3 试验方法

1.3.1 豆豉工艺流程及取样 毛霉型豆豉样品制备:黄豆精选去杂→浸泡12 h→熟化(121℃、20 min)→冷却→接种1%纯种毛霉菌(CGMCC8700),经过扩大培养→前发酵(15℃、64 h)→加入9%食盐、5%白酒→45℃密封后发酵42 d→成熟。前发酵取样时间为0、16、32、48、64 h,后发酵取样时间为0、7、14、21、28、35、42 d。

1.3.2 测定方法

1.3.2.1 HS-SPME/GC-MS 测定挥发性成分 HSSPME 方法萃取样品挥发性成分,将黑色75 μm Carboxen/PDMS 萃取头在GC 进样口温度为270℃的条件下老化0.5 h,备用;将不同发酵时期的豆豉样品(共12 个样品)进行研磨,分别取研磨后的豆豉样品约2 g 于15 mL 顶空进样瓶中,加入0.4 μL 0.946 mg·mL-1环己酮标准品和4 mL 超纯水,用密封垫和盖帽进行密封;然后在60℃条件下利用磁力搅拌器(转速300 r·min-1)预热20 min,将已活化的萃取头穿过密封垫插入顶空进样瓶内后推出纤维头,露出纤维头距离样品液面约10 mm,顶空吸附40 min,插入GC 进样口解析6 min。

气相色谱条件:CD-WAX 石英毛细管柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm);载气:高纯氦气(99.999%),流速1.0 mL·min-1;进样口温度:250℃;不分流进样。升温程序:柱温45℃,保持2 min,以5℃·min-1升至150℃,然后以15℃·min-1升至290℃。

质谱条件:离子源EI,温度200℃;发射电流150 μA;倍增器电压1 037 V;萃取头接口温度220℃;电子能量70 eV;质量扫描范围45~500 amu。

定性定量分析:采用NIST2 014s 标准质谱库检索,相似度在80%以上作为有效峰面积进行分析处理,根据保留时间确定不同发酵阶段毛霉型豆豉样品挥发性成分,用峰面积归一化法进行相对含量分析,用环己酮做内标进行挥发性成分定量分析。

1.3.2.2 电子鼻测定气味强度的变化 分别称取不同发酵阶段的豆豉样品3.0 g,装入密封塑料杯中,室温平衡30 min 后,插入电子鼻的进样针头进行测定。测定条件:采样时间1 s/组;传感器自清洗时间120 s;传感器归零时间10 s;样品准备时间5 s;进样流量400 mL·min-1;分析采样时间120 s。采用电子鼻内置程序(Winmuster,version 1.6.2)进行数据处理与分析。

1.3.2.3 电子舌测定滋味 分别称取5 g 研磨后的11 个不同发酵阶段豆豉样品,用20 mL 超纯水在50℃水浴中提取1 h,然后4 000 r·min-1离心20 min,取上清液作为待测样液,用于电子舌检测。电子舌传感器名称包括鲜味传感器、咸味传感器、酸味传感器、苦味传感器、涩味传感器、甜味传感器,分别对应基本味(相对值)为鲜味、咸味、酸味、苦味、涩味、甜味;对应的回味(CPA 值)为鲜味丰富度、无、无、苦味回味、涩味回味、无。

2 结果与分析

2.1 HS-SPME/GC-MS 分析豆豉不同发酵阶段挥发性成分分析

由表1可知,前发酵毛霉型豆豉样品共检出23 种挥发性成分,其中酯类5 种、醛类1 种、醇类11 种、酮类2 种、其他类4 种。熟化黄豆(前发酵0 h)中含有10 种挥发性成分,前发酵16 、32 、48 h 和前发酵结束时(64 h),挥发性成分的种类分别为11、13、7 和15种。前发酵是毛霉生长和酶系形成的时期,以毛霉特有的气味成分如1-辛烯-3-醇、异戊醇、乙醇为主。

毛霉型豆豉风味物质形成主要在后发酵时期,且与后发酵时间密切相关。由表2可知,后发酵7 个时期的挥发性成分总数量分别为15、24、27、27、30、30、31 种,总含量随着发酵时间延长呈先增加后降低并趋于稳定的趋势。

酯化反应是发酵豆豉产生香气的主要途径之一,由豆豉中游离脂肪酸、有机酸等酸类物质与醇类反应生成。酯类物质在毛霉型豆豉的发酵过程中总含量第二,其含量高于醛类、酸类等。后发酵14 d 时豆豉酯类含量高达41.81 μg·g-1,是发酵终止期(42 d)的3.13 倍,是后发酵0 d 的232.28 倍。酯类香气成分具有气味清、飘散快、易察觉的特征,毛霉型豆豉发酵过程中主要酯类物质有乙酸乙酯、丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、L(-)-乳酸乙酯等,且己酸乙酯含量在后发酵14 d 时最高,与陶湘林等[6]的研究结果相似,达到23.30 μg·g-1;乙酸乙酯赋予毛霉型豆豉果香气息[10];丁酸乙酯在豆豉后发酵成熟过程(28~42 d)中含量变化较为平稳,维持在1.00 μg·g-1左右,其具有强烈的甜果香、香蕉、凤梨和苹果气息,带玫瑰香气,味甜[11]。含量相对较低的戊酸乙酯赋予毛霉型豆豉甜、水果香气[12]。

表1 毛霉型豆豉前发酵过程中挥发性成分变化Table 1 Changes of volatile components content of Mucor-type Douchi during pre-fermentation /(μg·g-1)

醇类物质在毛霉型豆豉后发酵过程中共检出25种,含量高于其他类物质。醇类物质的产生主要与微生物代谢和后发酵期白酒或醪糟加入有关,使得毛霉型豆豉后发酵阶段乙醇含量较高,后发酵7 d 后各阶段均维持在23.00 μg·g-1以上。乙醇本身几乎无味,但会增加毛霉型豆豉的刺激感和浓郁度。异戊醇略带刺激性滋味,其含量仅次于乙醇。正己醇含量虽然不高,但其嗅觉阈值较低具有淡青嫩叶气息,略带酒香、果香和脂肪气息等风味特征[13]。不饱和醇类的香气阈值较低,对豆豉风味贡献较大,其中1-辛烯-3-醇又称松蕈醇,具有强烈的药草香韵,近似于玫瑰、薰衣草和干草的香气[14]。

醛、酮、酸类物质在后发酵阶段挥发性成分中总含量虽然较低,却是豆豉风味构成不可缺少的一部分[15-17]。在后发酵阶段醛类物质与酸类物质含量相当,但醛类物质种类高于酸类物质,醛类物质香气浓烈,多为花香及果香气味,微量的醛在毛霉型豆豉香气中起到调和作用。后发酵0~14 d 是醛类物质的生成阶段,在后发酵7 和14 d 时其总含量较高,且总含量均在1.50 μg·g-1以上。后发酵14~35 d 醛类物质开始降解,其含量下降至0.40 μg·g-1,最后进入到物质再平衡阶段,与后发酵35 d 相比发酵终止时其含量升高了0.03 μg·g-1。己醛作为亚油酸的代谢产物,具有一定的油脂味和腥味[18]。酮类物质性质稳定且香气持久,具有果香气味[19]。

毛霉型豆豉在后发酵阶段中酸类物质主要有乙酸、己酸和正戊酸,乙酸浓度较高时具有强烈、刺激性的特有气味,浓度适中时显酸味。后发酵14 d 以内脂质在水解酶的作用下不断产生酸类物质,在后发酵14 d 时达到1.35 μg·g-1。在检测到的3 种酸类物质中,己酸对酸味贡献最大,与生成己酸乙酯体现酱香味有关[20]。

毛霉型豆豉在后发酵35 d 时挥发性成分种类数量与后发酵42 d 时相差不大,但总含量比后发酵42 d高4.93 μg·g-1。后发酵35 d时豆豉中挥发性风味物质如酯类、醇类物质的含量高于后发酵42 d 的样品。综合表明,恒温发酵35 d 时豆豉风味基本稳定,继续发酵会影响产品的风味。

表2 毛霉型豆豉后发酵过程中挥发性成分含量变化Table 2 Changes of volatile components content of Mucor-type Douchi during post-fermentation /(μg·g-1)

表2(续)

2.2 电子鼻分析不同发酵阶段气味强度的变化

电子鼻作为一种电子感官分析方法,其可以获得与样品中挥发性化合物相关的所有信息[21]。由图1可知,前发酵0~64 h 由于风味物质较少传感器响应值较低。到45℃恒温发酵后,各类酶解反应和综合反应加速,风味物质快速形成,10 个传感器感应值也明显升高。由前面测定结果可知,后发酵阶段增加了乙酸乙酯、己酸等9 种挥发性成分,挥发性成分总含量增加了4.6 倍,该结果在图1 中得到验证。后发酵阶段样品的传感器R6(对甲烷灵敏)的响应值最大,其次为R8(对乙醇灵敏)、R9(对有机硫化物灵敏)、R7(对硫化物灵敏)。后发酵过程中由于白酒的加入,在后发酵7 d 时乙醇含量是后发酵0 d 的3.1 倍,这与加入白酒后的再平衡有关[22]。后发酵过程中产生了大量酯类物质,推测R6 传感器很可能对酯类风味成分灵敏。其余6 个传感器感应值较低,对区分不同发酵时期的毛霉型豆豉的香气变化影响较小。

图1 毛霉型豆豉发酵过程中10 个传感器的响应值Fig.1 Response values of ten sensors to Mucor-type Douchi during fermentation

毛霉型豆豉不同发酵阶段的电子鼻主成分分析(principal component analysis,PCA)结果见图2。主成分的累积贡献量为99.88%,大于95%,干扰较小,说明PCA 适用于不同发酵时期毛霉型豆豉电子鼻感应值分析。此外,毛霉型豆豉11 个样品可以分为两类,其中前发酵5 个样品为一类,后发酵6 个样品为一类,表明毛霉型豆豉前发酵与后发酵阶段样品气味差异明显,与挥发性成分测定结果一致。熟化黄豆挥发性成分总含量仅为6.48 μg·g-1,所以前发酵过程中5 个样品中发酵0 h 样品与其余4 个样品相距较远。前发酵48 h 样品位于发酵0 h 样品和其余3 个前发酵样品之间,说明前发酵48 h 样品与其余4 个样品的风味有共性;后发酵6 个样品呈聚集状态,且除后发酵42 d 样品外其他后发酵5 个样品重叠部分较多,表明后发酵样品具有较多共性物质。由表2可知,后发酵共有的酯类风味成分有乙酸乙酯、丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯和L(-)-乳酸乙酯;共有的醛类风味成分有己醛和3-甲硫基丙醛;同时含有己酸和乙酸等酸类风味成分;且均存在较多的乙醇、4-甲基-3-庚醇、1-辛烯-3-醇、异戊醇、2-乙基己醇等醇类风味成分,这些共性物质的存在说明后发酵是一个风味缓慢形成的过程。

图2 毛霉型豆豉不同发酵时期电子鼻的PCA 累计图Fig.2 PCA plot of Mucor-type Douchi samples taken at differentfermentation stages by E-nose

2.3 电子舌对不同发酵阶段滋味变化分析

电子舌以基准溶液(人工唾液)的输出为无味点,由于基准溶液中含少量盐和酸,因此盐味和酸味的无味点分别为-6 和-13[23],其他味觉值指标的无味点均为0。由表3可知,前发酵64 h 过程中无味点以下的指标是酸味,即前发酵过程中无明显人的味觉无法感知的酸味。这说明前发酵过程中代谢相对较少,以毛霉生长并形成酶系为主,因此该阶段样品甜味、苦味及涩味较明显,回味和丰富性较差。

表3 毛霉型豆豉前发酵过程中滋味味觉变化Table 3 Changes of taste value of Mucor-type Douchi during pre-fermentation

由表4可知,豆豉后发酵0~7 d,味觉值发生较大幅度变化。由于后发酵阶段加入了9%食盐和一定比例白酒,加之密封发酵有一个平衡过程,其盐味值从无激变到8.46,各种大分子物质进入再平衡阶段,豆豉的盐味值也得到平衡,其发酵成熟的盐味值为8.15,盐度适口。后发酵阶段豆豉的酸味值均低于-13,表明在豆豉正常发酵过程中均不存在人体味觉能够感知的酸味,这与谢靓等[24]的研究结果一致。进入后发酵阶段豆豉的苦味和涩味均大幅降低,分别降低了82.3%和91.6%,由于霉菌产生的亮氨酸氨肽酶对大豆多肽有很明显的脱苦效果[25],且亮氨酸氨肽酶与毛霉脯氨酸氨肽酶之间存在一定的底物选择互补,所以提高了脱苦效率[26]。毛霉型豆豉后发酵加入食盐和白酒进行调味同时酶活性缓慢释放,有机酸、氨基酸、多肽、低分子糖类等呈味物质缓慢生成,使得毛霉型豆豉的滋味丰富性大幅度提升,与前发酵阶段相比增加52.65%,甜味、苦味回味等感受值有所降低。在后发酵42 d 时,豆豉的苦味和涩味均维持在人体口感能够接受的范围之内,苦味回味与发酵时间呈反比。在发酵成熟时,苦味降低,后发酵阶段涩味回味值一直维持在0.30 左右,使豆豉达到一个良好的口感[27-28]。在各种味觉的共同作用下,形成了毛霉型豆豉咸、鲜、回味丰富而独特的风味。

表4 毛霉型豆豉后发酵过程中滋味味觉值变化Table 4 Changes of taste value of Mucor-type Douchi during post-fermentation

图3 毛霉型豆豉不同发酵时期电子舌的PCA 累计图Fig.3 PCA plot of Mucor-type Douchi samples taken at different fermentation stages by E-tongue

图3 为毛霉型豆豉不同发酵阶段的电子舌主成分分析图,图中每个数轴所显示的数值代表了电子舌每个传感器在每个数轴上的信息量,也叫做“成分”。主成分的累积贡献量为99.82%,说明其保留了原始数据大部分信息量,第一主成分贡献率89.50%,表明不同发酵时期毛霉型豆豉滋味间具有相同的信息量较大。从分布的区域来看不同发酵阶段样品共分为4类,前发酵0 h 豆豉样品甜味值较高、丰富性较低,被单独分为一类;前发酵16~48 h 样品滋味变化缓慢,为第二类;前发酵64 h(后发酵0 d)样品涩味回味、苦味回味增加、甜味降低,被分为第三类;后发酵7 d 至发酵结束为各种味觉相互协调和平衡的阶段,聚集为第四类。

由表5可知,不同阶段豆豉滋味的变化主要体现在甜味、丰富性、苦味回味和涩味回味上。由表4 和表5可知,毛霉型豆豉在发酵过程中甜味值下降,进入后发酵阶段人体味觉无法感知到甜味;但后发酵阶段分解、复合反应代谢产生了大量的醇类、酯类等物质,有文献报道毛霉型豆豉产品酯类、酸类、醛类、醇类、酮类、酚类和吡嗪类化合物含量高[29-32],即丰富性较好,电子舌测定滋味发现发酵使豆豉丰富性增强,说明HS-SPME/GC-MS 结合电子舌能够有效分析毛霉型豆豉发酵过程中风味变化。

表5 滋味指标贡献值Table 5 Contribution rates of taste properties

后发酵35 d 样品与后发酵42 d 样品均为毛霉型豆豉成品,后发酵35 d 成品鲜味、丰富性和苦味回味均优于后发酵42 d 成品,且盐味值比后发酵42 d 样品低0.07,口感更加柔和。结合感官评价结果认为,后发酵35 d 样品苦味适度,滋味最佳。

3 讨论

发酵大豆制品营养功能性已引起研究学者关注,但生产过程控制依赖经验性、品质不稳定仍是该行业发展的瓶颈。本试验将HS-SPME/GC-MS和电子感官技术相结合来研究豆豉发酵过程中风味、滋味变化,为豆豉生产过程的标准化、可控化提供了重要的方法和依据。这也与陈辰等[33]和胡荣锁等[34]采用HSSPME/GC-MS和电子感官技术评价产品滋味和风味变化结果一致。由此说明结合HS-SPME/GC-MS和电子感官技术对产品品质进行综合分析具有较高的可行性和可靠性。

本研究采用HS-SPME/GC-MS和电子感官技术对毛霉型豆豉发酵过程中风味和滋味相联系进行综合评价,确定豆豉在保温发酵过程中风味变化与滋味变化的趋势,为豆豉生产过程中品质和质量标准的建立奠定了基础。下一步研究应进一步建立数据模型找到毛霉型豆豉风味指纹图谱中品质风味密切相关的风味物质并确定风味阈值范围,建立理化指标基础上的风味指标、滋味评价指标,为数字化控制传统生产工艺奠定更好的基础,为传统发酵食品产业技术升级提供科学依据。

4 结论

本研究采用HS-SPME/GC-MS 结合电子舌、电子鼻分析了毛霉型豆豉发酵过程中的风味品质,HSSPME/GC-MS 结果表明,11 个豆豉样品在前发酵与后发酵的过程中共检测鉴定出68 种挥发性成分,其中酯类18 种、醛类7 种、酸类3 种、醇类26 种、酮类4 种、其他类10 种。电子鼻分析发现毛霉型豆豉在发酵过程中的气味随着发酵时间延长不断丰富化并趋于稳定。利用电子舌可以高效地辨别豆豉后发酵不同时期的滋味变化,不同发酵时间的豆豉味觉差异主要在甜味、丰富性、苦味回味和涩味回味上。结合风味物质变化和滋味变化认为,保温条件下豆豉后发酵35 d 趋于成熟,是毛霉型豆豉品质最佳点。本研究通过HSSPME/GC-MS 结合电子鼻、电子舌对毛霉型豆豉发酵过程中风味进行综合评价,为毛霉型豆豉生产标准化可控化数字化控制提供了重要参考。

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