孕期暴露PAHs对子代雄性大鼠生殖系统发育的影响

孟 瑾,关春雨,李 姝,袁 辉,许晓义,李 丽

(1.牡丹江医学院；2.牡丹江医学院附属红旗医院，黑龙江 牡丹江 157011)

近年来，重大环境污染事件频发，环境污染物严重损害男性的生殖健康，各种生殖系统疾病发病率逐年升高[1]。多环芳烃类化合物(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons，PAHs)在空气和水的污染中都很常见，它可以与颗粒物结合，或在空气污染本身的气态阶段形成小的悬浮物。接触这些污染物可导致PAHs在体内积聚，并通过一些直接和间接机制导致机体功能障碍，孕期暴露PAHs不仅可导致流产及早产率的增加，而且会造成子代出生缺陷[2]。苯并(a)芘(benzo(a)pyrene，BaP)是PAHs中最具有代表性的一种化合物，存在于煤焦油、煤炭加工废料、石油污泥、沥青和烟草烟雾中[3]。除职业性暴露外，BaP进入人体的主要途径是通过污染的食物，在烹饪过程中，氨基酸、脂肪酸和碳水化合物的热解可以产生BaP，因此通过饮水、食用烤肉或熏鱼等食物而接触到BaP的可能性非常高，会导致机体出现各种不良的健康影响，包括致癌、抑制免疫、致畸和激素水平异常等，BaP也可通过母体进而影响子代的正常发育。BaP还可增加活性氧(reactive oxygen species，ROS)的产生，ROS含量升高是男性不育的原因之一[4]。

本实验通过对孕期母鼠暴露BaP，检测子代雄性大鼠在儿童期(出生后4周)、青春期(出生后9周)、成年期(出生后12周)时的体重、睾丸重量、血清中睾酮(testosterone,T)水平，通过HE染色观察子代雄性大鼠睾丸形态学，检测子代雄性大鼠精子的活动度、活动率等精子形态学以及精子计数，进一步探讨PAHs对雄性生殖系统发育和功能的影响。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂光学显微镜(日本Olympus公司)，CPA2202S-DS电子天平(德国Sartorius公司)，PB-10酸度计(德国Sartorius公司)，微量移液器(德国Eppendorf公司)，旋转式切片机，包埋机。BaP(纯度>96%，美国Sigma公司)，睾酮ELISA检测试剂盒(美国Sigma公司)，0.5%～1%的伊红溶液，苏木素染液。

BaP暴露溶液的配制：将200mg BaP溶于20mL玉米油中，60℃水浴至完全溶解为10mg/mL的储备液，用玉米油将储备液分别稀释为2.5mg/mL、5mg/mL的BaP稀释液。

1.2 动物分组及暴露方法SD孕鼠18只(由牡丹江医学院比较医学中心提供，由牡丹江医学院动物福利与伦理委员会授权，生产批次号：20191018002，使用许可证号：SCXK黑2019-006)，体重250～280g，按体重随机分成3组，每组6只，分别为对照组(玉米油)、BaP低剂量暴露组(5mg/kg)、BaP高剂量暴露组(10mg/kg)。于妊娠第12～19天每天上午9：00～10：00，采用等体积经口灌胃染毒的方式，建立暴露模型，染毒容量2mL/kg。实验期间，动物饲养在独立通风隔离笼中，温度为22～24℃，相对湿度为40%～70%，12h光照黑暗交替，自由饮水进食，每天测定并记录孕鼠体重。

孕鼠自然分娩后，测量子代雄性大鼠在哺乳期(出生后2周)时的体重。于儿童期(出生后4周)、青春期(出生后9周)、成年期(出生后12周)分批处死子代雄性大鼠取血和睾丸。

1.3 子代雄性大鼠睾丸组织形态学观察将子代雄性大鼠睾丸组织置于4%甲醛固定液中固定，常规石蜡包埋、切片，厚度为4μm，HE染色，光镜下观察。

1.4 子代雄性大鼠睾酮含量检测采用ELISA测定子代雄性大鼠血清中T含量，操作按照试剂盒说明书要求进行，由牡丹江医学院附属红旗医院检验科完成。

1.5 子代雄性大鼠精子活性和数量测定取大鼠双侧附睾，置于生理盐水内清洗，洗净后置于4mL 37℃生理盐水中，以眼科剪剪碎，轻压组织碎块，静置2～3min释放出精子，制成精子悬液。取几滴悬液于清洁载波片上，于显微镜下直接进行观察有活性的精子数量占精子总数的百分比以及a、b级的精子数量占有活性的精子数量的百分比从而分别得出精子活动率和精子活动力；取精子悬液充入计数池，低倍镜下计数四个角4个大方格内精子的总数，按照精子数量=4个大方格内精子总数(N)/20×109的方法计算精子数量。

1.6 统计学方法实验数据均以“均数±标准差”表示。采用GraphPad Prism软件进行统计学分析。多组间比较采用单因素方差分析。进一步进行组间两两比较时，若方差齐时，采用SNK检验(Student-Newman-Keuls法)；若方差不齐时，采用Games-Howell检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 孕期暴露BaP对子代雄性大鼠生殖发育的影响与对照组相比，高、低剂量暴露组子代雄性大鼠在哺乳期、儿童期、成年期时体重呈显著下降(P<0.01)，在青春期时无明显统计学意义；与对照组相比，高、低剂量暴露组子代雄性大鼠在儿童期、青春期、成年期时的睾丸重量呈显著减轻(P<0.01)。与低剂量暴露组相比，高剂量暴露组的子代雄性大鼠在哺乳期时体重明显下降(P<0.01)，在儿童期时体重下降(P<0.05)，在青春期和成年期时无明显统计学意义；与低剂量暴露组相比，高剂量暴露组的子代雄性大鼠在儿童期时睾丸重量明显减轻(P<0.01)，在青春期和成年期时睾丸重量减轻(P<0.05)。见表1。

表1 孕期暴露BaP对子代雄性大鼠体重、睾丸重量等影响

注：与对照组比较，**P<0.01；与低剂量暴露组比较，#P<0.05，##P<0.01

2.2 子代雄性大鼠睾丸组织形态学变化光镜下观察可见，经过HE染色后，LC胞浆为深蓝色，细胞核不着色；对照组子代雄性大鼠LC聚集成簇分布，细胞数量较多；与对照组相比，高、低剂量暴露组切片中的LC集簇则呈不同程度减少，而且存在一定程度的生精细胞层数减少、空泡化、生精细胞间隙增大以及生精细胞脱落。见图1。

对照组 低剂量组 高剂量组

图1 子代雄性大鼠睾丸组织形态学(×10)

2.3 子代雄性大鼠睾丸组织中T水平的测定结果与对照组相比，高、低剂量暴露组的子代雄性大鼠在儿童期、青春期时T水平呈明显下降(P<0.01)，在成年期时T水平下降(P<0.05)；与低剂量暴露组相比，高剂量暴露组的子代雄性大鼠在儿童期时T水平明显下降(P<0.01)，在青春期和成年期时无明显统计学意义。见表2。

表2 孕期暴露BaP对子代雄性大鼠睾酮(T)水平的影响

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与低剂量暴露组比较，##P<0.01

2.4 子代雄性大鼠精子活性和数量的测定结果与对照组相比，高、低剂量暴露组的子代雄性大鼠在青春期和成年期时精子的数量明显减少、活动率和活动力明显降低(P<0.01)；与低剂量暴露组相比，高剂量暴露组的子代雄性大鼠在青春期时精子数量减少(P<0.05)、精子活动率和活动力明显降低(P<0.01)，在成年期时精子的数量也呈现明显减少、活动率和活动力明显降低(P<0.01)。见表3。

表3 孕期暴露BaP对子代雄性大鼠精子活性和数量的影响

注：与对照组比较，**P<0.01；与低剂量暴露组比较，#P<0.05，##P<0.01

3 讨论

PAHs污染广泛存在，主要来自于化学试剂和各种生产物质的燃烧。人们在日常生活中，可通过各种途径不同程度地暴露于PAHs，因此，PAHs的污染并不仅出现于职业暴露，普通人群一样也会受影响。由于PAHs不易降解，在环境中可长期稳定地存在，生物体可蓄积该类物质并产生中毒症状，也可导致严重的远期效应，如诱发基因突变及DNA损伤，已被认定为是具有致癌性的一类物质[5]。PAHs对生殖健康的危害同样严重，孕期暴露PAHs可能会造成母体流产或者早产[6]，出生后的子代也会面临生长缺陷的问题[7]。BaP作为PAHs最具代表性的环境污染物，目前已经被全世界的科研人员重点关注。

近期男性生殖障碍性疾病已经在全球范围内逐年增加，被认定为是一个极其严重的问题。男性儿童期、青春期和成年期的生殖系统畸变和疾病以及精子的发生、活动能力和数量发生异常统称为睾丸源性生殖障碍综合症(testicular dysgenesis syndrome，TDS)[8]。环境内分泌干扰物(endocrine-disrupting chemicals，EDCs)是一种外源性化合物，可能干扰内源性激素的合成、分泌、运输、代谢、受体结合或消除，改变内分泌和稳态系统[9]。雄性生殖系统发育最敏感的时期是怀孕的早期，目前已有研究证实TDS与孕期暴露EDCs密切相关[10]，EDCs会导致LC功能紊乱、T分泌不足等，出现TDS的一系列症状，如精子发生障碍、睾丸癌、睾丸不发达和尿道下裂等，这是被普遍认可的引起TDS的机制[11]。

体重的变化是进行动物实验的非特异性观察指标，可以整体体现动物体内的中毒情况，故在毒理学实验中备受关注[12]，在本实验过程中，与对照组相比，各剂量暴露组子代雄性大鼠在哺乳期、儿童期、成年期时体重均明显降低(P<0.01)；而在青春期时体重较对照组相比无统计学意义，我们推测可能与子代雄性大鼠机体的代偿有关。从实验结果中发现，与对照组相比，各剂量暴露组子代雄性大鼠在儿童期、青春期以及成年期时睾丸重量明显减轻(P<0.01)，说明BaP可以导致雄性生殖系统发育异常。

血清T水平的变化是LC中合成T的各种酶或蛋白质发生变化的综合表现。本部分实验结果显示，与对照组相比，各暴露组的子代雄性大鼠，不论是在儿童期、青春期还是成年期，血清中T水平均有下降(P<0.05或P<0.01)，提示BaP及其代谢产物可能通过对T合成相关激素水平或者酶活性的影响，抑制LC合成T的能力，使血清T水平下降来影响雄性生殖系统及其功能。

形态学的检测能反应出细胞水平的变化，通常作为机体异常的最直观的体现。与对照组相比，各暴露组睾丸组织切片中，LC细胞集簇呈不同程度减少，而且存在一定程度的生精细胞层数减少、空泡化、生精细胞间隙增大以及生精细胞脱落，提示BaP引起毒性作用的靶细胞之一可能是LC，其具体产生的机制还需要进一步的研究和探讨。

精子发生可分为三个不同的阶段。经过精原干细胞有丝分裂、精母细胞的减数分裂、精子细胞形成等过程，新生成的精子需要在附睾中获取能量后才能发育成熟，具有活性和运动能力。对于雄性个体来说，在生精过程中一定浓度的T是不可或缺的，T可以保证精子的生成，对于维持精子的活性、数量和质量起着关键作用[13]。本研究中发现高、低剂量暴露组子代雄性大鼠在青春期和成年期的精子数量明显减少(P<0.01)，精子活动力和精子活动率明显降低(P<0.01)，推测由于BaP的暴露，T浓度下降，影响精子的发生，导致精子的数量减少；精子在附睾中的成熟和获能也需要一定浓度的T，因此精子活动力和活动率也均出现明显下降。

综上所述，孕期暴露PAHs可使子代雄性生殖系统发育迟缓，具有生殖发育毒性作用；可使精子数量减少、精子活动力与活动率降低，出现生殖功能异常。子代雄性大鼠睾丸中LC数量减少、形态异常，提示LC是PAHs毒理作用的主要靶细胞之一。