CBD及水溶性CBD在人工胃液、肠液中稳定性研究

张煦然，范德凯，孙武兴，王曙宾

(汉义生物科技(北京)有限公司 生命科学研究院，北京 100176)

1 引言

大麻(CannabissativaL.)为桑科一年生草本植物，又名麻、汉麻、火麻、山丝苗、黄麻, 具有重要的农用及药用价值，世界各地都有广泛的栽培。作为一种古老的栽培植物，早在4000年前，《黄帝内经》中已有关于大麻的描述[1]。四氢大麻酚(THC)和大麻二酚(CBD)是大麻中重要的大麻素等[2,3]，其药理活性强，医药用途广泛，具有很好的开发和应用前景。药理研究证实，THC 的药理活性主要表现为抗肿瘤、保护心血管和抗菌等，而CBD除上述活性外，还具有神经保护、代谢和免疫调节、抗炎抗氧化和护肝等作用[4]。

THC和CBD互为同分异构体[5]，化学结构式见图1，有研究报道[6]，在正常胃肠运输过程中，口服CBD在酸性胃环境中会迅速形成Δ9-THC和其他精神活性大麻素。本次实验对CBD和水溶性CBD在人工胃液、人工肠液中进行稳定性实验，并对CBD在人工胃液中是否快速产生THC的实验结论进行验证。

图1 (a)四氢大麻酚(THC)和(b)大麻二酚(CBD)的化学结构式

2 仪器与材料

2.1 仪器

岛津LC-16型高效液相色谱仪(包括真空在线脱气机、二元泵系统、自动进样器、柱温箱、DAD检测器、LabSolutions工作站)，日本岛津公司；SHA-B型水浴恒温振荡器(天津市赛得利斯实验分析仪器制造厂)；SQP型电子天平(Satorious)；FE28-standand型pH计(METTLER TOLEDO)。

2.2 材料

大麻二酚(CBD，批号20180801，含量96.66%，来源：云南汉素生物科技有限公司，实验室标定)；四氢大麻酚(THC，批号FE08221804，浓度1 mg/mL，规格1 mg，含量99.39%，来源：SIGMA-ALORICH)；水溶性CBD(含量：10%，批号20190706，来源：云南汉素生物科技有限公司)；甲酸和乙腈为色谱级；盐酸、无水乙醇、氯化钠、十二烷基硫酸钠(SDS)、磷酸二氢钾为分析级；胃蛋白酶和胰蛋白酶为生化试剂。

3 方法与结果

3.1 对照品溶液的制备

精密量取THC对照品适量，置50 mL量瓶中，加甲醇稀释制成20 μg/mL的THC对照品贮备液。精密称取CBD对照品适量，置50 mL量瓶中，加甲醇稀释制成300 μg/mL的CBD对照品贮备液。分别取CBD和THC对照品贮备液适量，混匀，得到每1 mL中含有CBD 150 μg和THC 10 μg的混合对照品溶液。

3.2 稳定性考察试剂制备

(1)试剂①：人工胃液。取稀盐酸(取盐酸234 mL，加水稀释至1000 mL制得)8.2 mL，加水约400 mL与胃蛋白酶5 g，摇匀后，加水稀释成500 mL。

(2)试剂②：不含胃蛋白酶的人工胃液。取稀盐酸(取盐酸234 mL，加水稀释至1000 mL制得)，加水稀释至500 mL，配置成不含胃蛋白酶的人工胃液。

(3)试剂③：含0.2%NaCl人工胃液。取氯化钠0.2 g，置100 mL量瓶中，加人工胃液溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

(4)试剂④：人工肠液。取磷酸二氢钾3.4 g，加水250 mL使溶解，用0.1 mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.8；另取胰酶5 g，加水适量使溶解，将两液混合后，加水稀释至500 mL。

(5)试剂⑤：不含胰蛋白酶的人工肠液。取磷酸二氢钾3.4 g，加水250 mL使溶解，用0.1 mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.8，加水稀释至500 mL配置成不含胰蛋白酶的人工肠液。

(6)试剂⑥：含1%SDS、0.2%NaCl人工胃液。取稀盐酸(取盐酸234 mL，加水稀释至1000 mL制得)8.2 mL，加水约400 mL，加5 g SDS。取1.0 g氯化钠，1.6 g胃蛋白酶(猪粘膜)加水100 mL溶解，将两溶液混合。

(7)试剂⑦：0.2%Nacl溶液。取氯化钠0.2 g，置100 mL量瓶中，加纯化水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

(8)试剂⑧：含1%SDS人工胃液。取SDS 0.5 g，置50 mL量瓶中，加人工胃液溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3 供试品溶液制备

CBD稳定性考察：取CBD约12 mg，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入无水乙醇14 mL，溶解后分别精密加入配制试剂①、③、⑥、⑧各10 mL，摇匀，放置水浴恒温振荡器(温度：37 ℃、转速：160 r/min)中，分别于0 h、1 h、3 h、24 h精密量取1 mL，置5 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，过0.22 μm微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液。

水溶性CBD稳定性考察(加乙醇)：取水溶性CBD约120 mg(约含CBD 12 mg)，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入无水乙醇14 mL，溶解后分别精密加入配制试剂①、②、④、⑤、⑥、纯化水各10 mL，摇匀，放置水浴恒温振荡器(温度：37 ℃、转速：160 r/min)中，分别于0 h、1 h、3 h、24 h精密量取1 mL，置5 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，过0.22 μm微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液；

水溶性CBD稳定性考察(未加乙醇)：取水溶性CBD约120 mg(约含CBD 12 mg)，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入纯化水14 mL，溶解后分别精密加入配制试剂①、③、⑥、⑦，摇匀，放置水浴恒温振荡器(温度：37 ℃、转速：160 r/min)中，分别于0 h、1 h、3 h、24 h精密量取1 mL，置5 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，过0.22 μm微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液。

2.4 色谱条件

采用Sepax GP-C18色谱柱 (4.6 mm×150 mm，3 μm，120 Å)；流动相为0.1%甲酸溶液(流动相A)-0.1%甲酸的乙腈溶液(流动相B)，梯度洗脱(0～6 min，30%A；6～12 min，30%～23%A；12～22 min，23%A；22～22.2 min，23%～30%A；22.2～32 min，30%A)；流速：1.2 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：220 nm；进样量：10 μL。混合对照品中CBD和THC色谱图见图2。

图2 CBD和THC对照品溶液的HPLC色谱图1.CBD：9.134 min； 2.THC：16.322 min

2.5 水溶性CBD稳定性考察结果

2.5.1 水溶性CBD稳定性考察(加乙醇)

在人工胃液中，CBD含量在24 h内降解1.83%，产生0.29%THC；不加胃蛋白酶人工胃液中，CBD降解速度与人工胃液条件试验结果一致；在含1%SDS、0.2%NaCl人工胃液中，CBD在24 h含量降解76.62%，THC产生21.25%。在人工肠液和水液中，CBD未降解，也未检测出THC。水溶性CBD(加乙醇)溶液0 h～24 h稳定性样品色谱图见图3～6，结果见表1。

图3 水溶性CBD(加乙醇)溶液0 h色谱图

图4 水溶性CBD(加乙醇)溶液1 h色谱图

色谱图3～6中，a、b、c、d、e、f依次为人工胃液、人工肠液、不含胃蛋白酶的人工胃液、不含胰蛋白酶的人工肠液、含1%SDS和0.2%NaCl人工胃液、纯化水。

图5 水溶性CBD(加乙醇)溶液3 h色谱图

图6 水溶性CBD(加乙醇)溶液24 h色谱图

2.5.2 水溶性CBD稳定性考察(未加乙醇)

水溶性CBD在人工胃液中溶解，不用加乙醇助溶。在含1%SDS，0.2%NaCl人工胃液中，CBD含量在24 h内降解28.1%，THC产生8.15%；在人工胃液、0.2%NaCl人工胃液、0.2%NaCl溶液中，CBD在24 h未降解，未检测到THC。水溶性CBD(未加乙醇)溶液0 h～24 h稳定性样品色谱图见图7～10，结果见表1。

图7 水溶性CBD溶液0 h色谱图

图8 水溶性CBD溶液1 h色谱图

图9 水溶性CBD溶液3 h色谱图

图10 水溶性CBD溶液24 h色谱图

色谱图7～10中，a、b、c、d依次为含1%SDS和0.2%NaCl人工胃液、人工胃液、含0.2%NaCl人工胃液、 0.2%NaCl溶液。

2.6 CBD稳定性考察结果

CBD不溶于人工胃液，加乙醇后全部溶解。在人工胃液中，CBD含量在24 h降解0.64%，THC产生0.28%；在含1%SDS、0.2%NaCl人工胃液中，CBD含量在24 h降解0.64%，THC产生0.28%；人工胃液单独加SDS、Nacl，CBD在24 h降解率，THC产生率与“含1%SDS、0.2%NaCl人工胃液人工胃液”结果一致。CBD粉溶液0 h～24 h稳定性样品色谱图见图11～14，结果见表1。

图11 CBD粉溶液0 h色谱图

色谱图11～14中，a、b、c、d依次为人工胃液、含1%SDS和0.2%NaCl人工胃液、含0.2%NaCl人工胃液、含1%SDS人工胃液。

3 讨论

通过CBD和水溶性CBD在人工胃液及肠液稳定性试验，可知使CBD降解的主要条件为HCL溶液，加入乙醇或者1%SDS后CBD降解迅速并产生THC，胃蛋白酶、胰蛋白酶、低浓度的NaCl(0.2%)溶液不会使CBD降解生成THC。水溶性CBD不含有乙醇和1%SDS的情况下，在人工胃液中比较稳定，不会产生THC；CBD和水溶性CBD在加入乙醇的情况下，在人工胃液中会产生THC。

图12 CBD粉溶液1 h色谱图

图13 CBD溶液3 h色谱图

图14 CBD溶液24 h色谱图

表1 稳定性考察结果

续表1

考察项目时间/h水溶性CBD(加乙醇)水溶性CBD(未加乙醇)CBD(加乙醇)CBD测得量/mg降解率/%THC含量/%CBD测得量/mg降解率/%THC含量/%CBD测得量/mg降解率/%THC含量/%2411.681.700——————纯化水013.6800——————111.4916.010——————311.4916.030——————2411.4916.030——————

CBD对于多发性硬化症、精神分裂症、双相躁狂、社交焦虑症、失眠、亨廷顿病和癫痫等疾病的治疗具有良好的效果[7,8]。如FDA审批上市的GW公司抗癫痫新药Epidiolex，采用植物油溶解CBD，在进入胃肠道过程中可以降低精神活性大麻素形成的可能性，提高用药安全性。利用先进的制剂技术开发水溶性CBD，提高CBD在水中的溶解度，不仅可以提高其生物利用度，且极大拓展了其应用场景。