纳米氧化锌改性复合树脂即刻抗菌性能及其机制的研究

梁蓓蕾 逯宜 李蕴聪 刘瑞瑞

复合树脂由于色泽美观、操作简便等优点而广泛应用于口腔临床各种牙体缺损修复和美容修复之中[1]，但因其自身理化性质制约及聚合收缩引起的结构缺陷，容易在细菌及其产物的作用下发生降解，导致修复体出现边缘渗漏、继发龋乃至脱落失败[2]。许多学者曾尝试在复合树脂中添加抗菌剂对其改性来解决这一问题[3-4]。

纳米氧化锌(nano-ZnO)作为一种新型多功能无机纳米材料，具有优良的抗菌性能，同时兼具纳米晶粒的优点，其抗菌性能较普通氧化锌更加出色，已经成为无机抗菌剂研究的热点之一[5-6]。本实验将nano-ZnO作为无机填料的一部分加入复合树脂中，通过对其即刻抗菌性能的测定及及其抗菌机制的初步探索，研究nano-ZnO抗菌改性复合树脂的可能性，为进一步研究探索具有抗菌性能的树脂提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料与仪器

1.1.1 实验材料 双酚A 双甲基丙烯酸缩水甘油酯/双甲基丙烯酸二缩三乙二醇酯(Bis-GMA/TEGDMA)混合物、硅烷化处理的无机填料、光引发剂樟脑醌(CQ)、胺促进剂(DMAEMA)(Esstech公司，美国)；纳米氧化锌(17 nm,北京博宇高科新材料技术有限公司)；变形链球菌(UA159，第四军医大学口腔医院检验科)；脑心浸液培养基、脑心浸液琼脂(北京陆桥技术有限责任公司)；锌(Zn)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)；24 孔细胞培养板、96 孔细胞培养板(Corning公司，美国)。

1.1.2 实验仪器 电子天平(Denver公司,美国)；可见光固化灯(Spectram，Dentsply公司，美国)；酶标仪(BMG公司，德国)；超纯水仪(Millipore公司，美国)；高压蒸汽灭菌锅(上海博讯公司)；无菌操作台(苏州净化设备厂)；电热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂)；MGC厌氧培养罐及厌氧产气袋(三菱公司，日本)；漩涡混合器(Vortex QL-901，江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司)；微量加样器(Eppendorf公司，德国)。

1.2 样本的制备与分组

1.2.1 实验分组 实验所用复合树脂均在实验室条件下进行配制。实验组复合树脂所含填料由nano-ZnO与硅烷化处理的无机填料两部分组成，其添加总量均恒定为70%，依照填料中nano-ZnO所占比例不同设置3 个实验组(nano-ZnO添加量依次为1%、5%、10%)，空白对照组填料中不含nano-ZnO。

1.2.2 复合树脂的制备 称取混合树脂体系(Bis-GMA/TEGDMA)(BGT)，避光条件下加入光引发体系(CQ和DMAEMA添加量均为1%)，均匀混合后按照实验分组加入相应质量分数的填料(表1)，搅拌均匀后避光保存备用。

表1 复合树脂各组分组成比例Tab 1 The proportion of modified composite resin

1.2.3 样本的制备 制作内径 10 mm、厚度2 mm的金属模具，按照实验分组分别使用各组对应树脂制备试件，每组6 个，充分光固化后脱模，37 ℃条件下浸泡于无菌三蒸水中24 h备用，实验前使用无菌水反复冲洗并用70%乙醇溶液消毒擦拭试件表面，无菌水再次冲洗后干燥备用。

1.3 实验方法

1.3.1 抗菌性能测定 取一定量复苏后的变形链球菌，加入脑心浸液培养基中37 ℃厌氧培养18～20 h(N2：85%，CO2：5%，H2：10%)。将已消毒备用的试件分别放入每孔加有入1.8 ml脑心浸液培养基和0.2 ml菌液的24 孔细胞培养板中，37 ℃厌氧培养24 h后将试件取出，放置于加有10 ml脑心浸液培养基的试管中，剧烈震荡1 min，充分洗脱试件表面黏附的细菌。洗脱液倍比稀释后，接种于脑心浸液琼脂平板上，厌氧培养24～48 h，以平板上菌落数为30-300的平板为准进行菌落计数，按照下述公式计算抗菌率。

r(%)=[(b-c)/b]×100%

r:抗细菌率(%);b:空白对照试件组的平均菌落数(CFU/片);c:nano-ZnO改性光固化复合树脂试件组的平均菌落数(CFU/片)。

1.3.2 锌离子释放量的测定 为测定各组光固化复合树脂的锌离子释放量，将各组样本浸泡于装有4 ml无菌三蒸水的试管中，37 ℃保存，于24 h时取浸析液，依照锌(Zn)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)说明，取10 μl待测样本依次与160 μl试剂一、40 μl试剂二进行混合，并在37 ℃条件下进行孵育。使用560 nm波长分别于2 次混合后测定其吸光度值A1，A2，按照下述公式计算锌离子浓度，再按照溶液体积计算相应时期的锌离子释放量。

锌离子浓度(mol/L)=C标准×ΔA测定/ΔA标准

ΔA=A2-A1

其中，C标准和A标准均为试剂盒中所含锌离子标准液测定结果。

为去除无菌三蒸水中可能含有的离子物质所造成的误差，实验计算所得锌离子释放量需减去相同剂量无菌三蒸水样品所得结果的均值才能作为实际锌离子释放量。

1.4 统计学分析

使用SPSS 19.0软件进行统计学分析，通过单因素方差分析(one-way ANOVA)比及LSD-t检验(Fisher's least significant test)多重比较分析各组之间的差异，P<0.05时差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 改性复合树脂的即刻抗菌率

不同nano-ZnO添加量改性复合树脂的即刻抗菌率如表2所示。各组复合树脂样品培养所得变形链球菌菌落生长情况如图1所示。

由于1%ZnO组抗菌率数值过低，为评估其是否具有抗菌作用，使用两独立样本t检验比较其与空白组间菌落个数的差异，结果显示1%ZnO组与空白组间菌落计数的差异无统计学意义(t=0.408，P=0.692)，可以认为nano-ZnO的添加量为1%时，复合树脂未被赋予额外的抗菌性能。

表2 各组nano-ZnO改性复合树脂的即刻抗菌率Tab 2 The immediate antibacterial rate of nano-ZnO modified composite resin

注：不同右上标数字序号表示：不同nano-ZnO添加量改性复合树脂组间即刻抗菌率之间的差异有统计学意义(P<0.05)

2.2 改性复合树脂锌离子释放量

各组nano-ZnO添加量改性复合树脂浸析液所得锌离子释放量如图2所示。不同nano-ZnO添加量改性复合树脂浸析液中锌离子释放量的差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨 论

在口腔医学领域，已有许多国内外学者关注到nano-ZnO的优点并对其应用进行深入探索。研究[5-7]证实nano-ZnO抗菌剂对口腔常见致病菌有较强的抑制杀灭作用，作为根管封闭剂，取得了较普通ZnO封闭剂更明显的根尖封闭疗效；曹香林等[8]研究了以nano-ZnO作为填料组分的热凝树脂基托的抗菌性能及机械性能，结果显示在一定的添加剂量内，树脂基托对变形链球菌的抗菌作用随nano-ZnO含量的提高而逐渐增强；Toledano等[9-11]发现用含nano-ZnO的粘接剂处理脱矿牙本质表面能提高其与树脂的即刻粘接强度，降低混合层胶原的降解，并具有促进龋损组织再矿化的潜力；Tavassoli Hojati等[12]尝试将nano-ZnO添加在流动树脂当中，并证明nano-ZnO可以使流动树脂具备一定的抗菌性能，并且能够提高流动树脂的粘接强度及部分机械性能。如上所述，nano-ZnO已在口腔医学领域获得广泛的应用，本试验结果也表明，加入nano-ZnO确实能够使复合树脂具有抑制变形链球菌生长的能力，且这一抑制能力随着nano-ZnO含量的增加而逐渐提高。

A:对照组；B：1% ZnO;C:5% ZnO;D:10% ZnO图1 各组复合树脂即刻抗菌性能测定的变形链球菌菌落生长情况A:Control;B：1% ZnO;C:5% ZnO;D:10% ZnOFig 1 The growth of Streptococcus mutans colonies in the groups

图2 各组nano-ZnO改性复合树脂浸析液锌离子释放量(10-2 μmol)Fig 2 The amount of zinc ions(10-2 μmol) released from the nano-ZnO modified composite resin of each group

目前nano-ZnO的抗菌机制虽然尚不明确，但有许多学者认为nano-ZnO能够缓慢的释放出Zn2+，可以依靠异种电荷间的相互吸引结合到细菌表面，破坏细胞膜的生物性能，抑制细菌的生长和繁殖；同时，过剩的Zn2+也穿过细胞膜进入细胞内部，与细菌体内的蛋白质，DNA等发生反应，妨碍细菌的正常功能活动及代谢从而达到抗菌的目的。当前细菌被杀灭之后，Zn2+又会从细菌中游离出来，与其他细菌发生接触，再次通过以上机制发挥抗菌作用[13-15]。本试验表明，在水溶液体系中，含有nano-ZnO作为填料组分的复合树脂均可以检测到锌离子的释放，同即刻抗菌率所得结果相同，其释放量也随nano-ZnO添加量的增加而增加，这从侧面表明Zn2+的释放是nano-ZnO重要的抗菌机制之一。

在实际临床操作中，窝洞预备常无法将病损中的细菌完全去除干净，微渗漏建立的通道也使口腔内的微生物能够自由进出，然而复合树脂相较于其他牙科材料更容易黏附和聚集细菌。通过本实验结果表明使用nano-ZnO改性复合树脂，可以赋予其抗菌活性，对牙体-充填体界面及充填体表面的细菌发挥抑制作用，降低继发龋产生的可能性，为临床新型抗菌牙科材料的研发提供了必要的实验依据，但其长效性及更深层次的抗菌机制的探讨还需进一步的研究及努力。