复合重金属铅和镉胁迫对洋甘菊生理指标的影响

陶月，郭荣慧，范铭，吴恒梅，姜成

(佳木斯大学生命科学学院，黑龙江佳木斯154007)

目前，土壤被重金属污染的相关环境问题吸引了人们的注意力。随着逐年增长的人口数量及迅速发展的经济，我国必须要面对愈发严重的土壤环境的安全问题。据相关资料统计，我国近2×107hm2的耕地面积已受到重金属污染，约占全国总耕地面积的20%，被重金属污染的粮食每年可达1.2×104万t，造成200亿元的直接经济损失。如何安全高效的把重金属污染的土壤修复，是我们的首要任务。植物修复作为重金属污染治理技术，因其成本低、对土壤安全、无污染等优势，越来越受到人们的重视。寻找对重金属污染耐受性较强的植物，是实现植物修复的前提条件，目前对重金属研究多数集中在花卉和农作物上，尚鲜见研究复合重金属对药用植物影响的研究，洋甘菊提炼出的产物是比较流行的保健和药物制品，具有缓解失眠、发炎等功效，具有一定经济效益，研究洋甘菊在重金属污染下的相关生理指标的变化，探索其是否具有较强的重金属耐受性，对于筛选重金属污染修复药用植物具有重要意义，将为药用植物应用于重金属污染土壤修复奠定理论研究基础。

1 研究材料与方法

1.1 试验材料

洋甘菊种子由佳木斯大学科技园实验中心提供，重金属添加方式为硝酸铅和氯化镉。

1.2 试验方法

将各浓度梯度的重金属溶液与土壤充分混合，放置阴凉处处理30～50 d。选取饱满的洋甘菊种子每盆50粒，均匀播入土壤中，6次重复，5个处理(添加复合重金属铅和镉浓度依次为20-100、40-200、60-300、80-400、100 mg/kg-500 mg/kg)，置于光照培养室进行培养，每天适当补充水分[1]。第5 d测定种子的出苗率，60 d后测定过氧化物酶活性、脯氨酸含量等生理指标。

1.3 过氧化物酶活性的测定

取1g洋甘菊的叶片，将叶片剪碎，放置于研钵内，取5 mL磷酸缓冲溶液加入，研成匀浆，4000 r/min离心10 min。将离心所得的上清液转入试管内保存于冷处，其余沉淀用5 mL磷酸缓冲液再提取一次，量出合并上清液的总体积，备用保存于低温处。将反应混合物取3 mL加入0.1 mL提取酶溶液至比色杯中，对照用反应混合物3 mL加入0.1 mL磷酸缓冲液至比色杯中。立即测OD470，10 min后重复测量，根据以下公式计算出相应的过氧化物酶的活性[2]。

过氧化物酶活性=(ΔD470×Vt)/(W×Vs×0.01×t)(μ/g·min)

式中：W为样品鲜重；t为反应时间；Vt为总体积；Vs为测定时吸取的体积。

1.4 脯氨酸含量的测定

秤取0.5 g洋甘菊幼苗清洗干净放入比色管中，加入3%磺基水杨酸5 mL，盖盖浸提10 min(经常摇动)于沸水浴中，冷却后，取干净的比色管，过滤，即为洋甘菊脯氨酸的提取液。取2 mL提取液至于比色管内加入2 mL冰醋酸、3mL酸性茚三酮，加热40 min于沸水浴中，溶液呈现红颜色，以甲苯为对照，测OD520，根据脯氨酸含量的标准曲线，查出脯氨酸含量a。由脯氨酸含量计算公式即得出洋甘菊幼苗脯氨酸的含量[3]。

结果计算：

脯氨酸含量 =(a×Vt/Vs)/(W×106)×100%

式中：W为样品鲜重；a为提取液中的脯氨酸浓度值，由标准曲线求得；Vt是总体积；Vs为测定时吸取体积。

1.5 数据分析

采用SPSS 22.0软件统计分析，用Duncan法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 出苗率

出苗率可以直观反应种子的发芽情况，不同浓度的铅和镉胁迫下洋甘菊种子的萌发具有一定程度的影响[4]。由图1可知，洋甘菊出苗率随复合重金属铅和镉处理浓度的增加呈现趋势为先上升后下降，在复合重金属铅-镉处理浓度是40 mg/L-200 mg/L时，洋甘菊出苗率达到54.43%，为最大值。表明复合重金属铅和镉对洋甘菊出苗率表现为低促髙抑的作用，从出苗率反映出其对重金属铅和镉胁迫的最大耐受浓度为40 mg/L-200 mg/L。

图1 铅镉复合污染对洋甘菊出苗率的影响

2.2 铅和镉复合胁迫对洋甘菊幼苗过氧化物酶的影响

图2 铅镉复合污染对洋甘菊幼苗过氧化物酶的含量的影响

过氧化物酶的作用主要是将过氧化氢水解，过氧化氢是氢催化酶催化的氧化还原反应中的细胞毒性物质，过氧化物酶体中存在氧化酶和过氧化氢酶，起保护细胞的作用[5]。复合重金属铅和镉胁迫对洋甘菊幼苗过氧化物酶的含量的影响见图2，可以发现随着复合重金属浓度增大，过氧化物酶的含量逐渐增大，与对照相比，各处理浓度的过氧化物酶含量均高于对照，且差异显著(P<0.05)。

2.3 复合重金属铅和镉胁迫对洋甘菊幼苗脯氨酸含量的影响

植物体内的脯氨酸含量在逆境条件下增加显著，且能在一定范围内反映出植物的抗逆性。因此通过对脯氨酸含量的测定可以用于抗旱育种的生理指标评价标准之一[6]。由图3可知随着复合重金属浓度的增加，洋甘菊幼苗的脯氨酸含量逐渐增大，当复合重金属铅-镉浓度高于60mg/kg-300mg/kg时，洋甘菊幼苗的脯氨酸含量显著高于对照(CK)，分别升高了2.28倍、2.34倍、2.46倍(P<0.05)。说明复合重金属污染增大洋甘菊幼苗植物组织抗旱能力。

图3 单因素复合浓度污染对洋甘菊幼苗脯氨酸的含量的影响

3 讨论

3.1 复合重金属铅和镉对洋甘菊出苗率的影响

植物的出苗率能既能反映种子的质量和活力 ，也能反映植物对重金属胁迫的抗性能力。陈顺钰[7]等人的研究表明Pb和Cd对种子发芽率无显著的影响(P>0.05)，但对幼苗的生长有显著的抑制作用(P<0.05)。李雨心[8]研究表明高浓度的重金属污染容易对特定植物的发芽率产生抑制现象，并随着胁迫浓度的增加抑制现象明显。孙博文[9]等人的研究表明单一Pb、Cd处理时，对植物的发芽率、主根长均出现高浓度抑制。该试验结果表明低浓度的复合重金属胁迫对洋甘菊种子的出苗率无显著影响，高浓度的复合重金属胁迫对洋甘菊种子的出苗率抑制显著。该结果与陈顺钰[7]等、李雨心[8]、孙博文[9]等的研究结果相似。另外从该试验中也可看出，低浓度的复合重金属Pb2+、Cd2+对种子出苗率有轻微的影响，但与CK相比差异不明显，高浓度的复合重金属胁迫具有较大的抑制作用，出现这种情况的原因是由于洋甘菊种子在复合重金属Pb2+、Cd2+的胁迫下具有一定的耐受作用，从而在低浓度的复合重金属胁迫下并不会出现明显的毒害现象，但在高浓度胁迫下，毒害作用过大，从而使出苗率受到显著抑制。

3.2 复合重金属铅和镉对洋甘菊幼苗过氧化物酶含量的影响

朱红霞[10]等人的研究表明随着镉胁迫的浓度升高，渗透调节物质和抗氧化酶活性呈现先升高后降低的趋势。陈顺钰[7]等人研究表明随重金属胁迫时间延长POD活性显著升高。余国源[11]研究表明重金属胁迫下伞房决明的生长受到轻微抑制，POD活性上升。该试验结果表明在复合重金属胁迫下，洋甘菊幼苗过氧化物酶的含量随重金属浓度增高逐渐增加。该试验结果与朱红霞等[10]、陈顺钰等[7]和余国源[11]的研究结果相似。本研究还发现相同复合重金属浓度胁迫下过氧化物酶含量会随时间的增加而增加，当复合重金属浓度超过一定阙值时，植物将出现毒害甚至死亡的现象。

3.3 复合重金属铅和镉对洋甘菊幼苗脯氨酸含量的影响

脯氨酸在植物体内不仅是理想的调节渗透物质，还是膜和酶的自由基清除剂，从而在渗透胁迫下对植物的生长起一定的保护作用，在逆境条件下含量增加显著，且能在一定程度上反映出植物的抗逆性。高秉婷[12]等研究表明，Zn2+胁迫会对脯氨酸含量、MDA含量、SOD活性产生显著影响。蔡雄伟[13]研究表明铅胁迫能使狗牙根叶中游离的脯氨酸含量增多。该试验结果表明在复合重金属铅和镉胁迫下，洋甘菊幼苗脯氨酸的含量随浓度升高而增大，与高秉婷[12]、蔡雄伟[13]研究结果相似。由于植物组织的抗逆性具有一定的阙值，当受害程度超出阙值范围，则植物出现受损、停止生长甚至死亡的现象。

4 结论

多数生理生化指标均与植物抗重金属污染的能力有关，采用盆栽试验研究复合重金属铅和镉胁迫对洋甘菊幼苗的影响，洋甘菊幼苗过氧化物酶含量及脯氨酸含量均随复合重金属胁迫浓度的增高而增多，但洋甘菊的出苗率表现为低浓度影响不显著，高浓度抑制。结果表明复合重金属铅和镉胁迫对洋甘菊种子萌发产生一定的毒害作用。可能是通过抑制种子中的淀粉酶、蛋白酶的活性进而影响洋甘菊种子的新陈代谢，降低营养利用的能力而产生的。本研究为复合重金属胁迫对药用植物的生理指标的影响提供有价值的理论依据。