健脾固肠方通过提高短链脂肪酸产生菌的丰度减轻肠癌小鼠化疗后肠道炎症反应的机制探讨❋

周张杰，蒋海燕，钟 薏Δ，沈 伟，李 芸，付淑娟，吴婷婷，夏晓婷，张士强，杨 蕴，刘新华

(1.上海中医药大学附属上海市中西医结合医院肿瘤科，上海 200082；2.上海交通大学附属新华医院肛肠外科，上海 200092；3.上海中医药大学科技实验中心，上海 201203)

化疗是治疗结肠癌的重要方法之一，但其容易导致肠道菌群失调，引起恶心、呕吐、腹泻等并发症，这些并发症严重影响化疗期间结肠癌患者的生活质量，导致化疗中止甚至危及生命[1-2]。肠道微生物群会通过紧密连接肠道上皮细胞调节宿主肠道微环境，并最终影响肠道屏障[3]。

中医临床采用辨证治疗的方法，认为脾气不足可导致肠黏膜血流停滞，进而使肠黏膜的防御功能变弱，最终导致肠黏膜损伤[4]。相关研究表明，四君子汤可以促进大鼠正常肠上皮细胞的增殖，有助于恢复肠黏膜的免疫平衡[5]。健脾固肠方以四君子汤为底方进行加减，发现该方能降低化疗后患者的二胺氧化酶、D-乳酸水平(P<0.05)，说明该方能明显降低患者肠道屏障的损伤[6]。但其机理不明，于是进行基础实验验证其是否通过调节肠道菌群缓解肠道炎症反应，进而减轻患者化疗后肠道屏障的损伤。

1 材料

1.1 细胞与动物

1.1.1 实验动物 Balb/cSPF级雄性小鼠14只，4～6周龄，购自上海斯莱克有限公司动物，饲养于上海中医药大学动物试验中心。本实验通过上海中医药大学动物伦理委员会审查。

1.1.2 细胞 鼠源CT26.WT结肠癌细胞购自中科院上海细胞库。

1.2 实验器材

胎牛血清、PBS、RPMI-1640培养基，购自Gibco有限公司；健脾固肠方中药颗粒剂组成：党参、白术、茯苓、甘草等，购自江阴天江药业有限公司。取蒸馏水定容至1.443 g/ml；奥沙利铂50 mg，购自江苏恒瑞医药股份有限公司；5-氟尿嘧啶10 ml：0.25 g，购自天津金耀氨基酸有限公司；0.9%氯化钠溶液，购自凯恒有限公司；组织胶水，购自德国博朗有限公司；异氟烷，购自深圳市瑞沃德生命科技有限公司；动物麻醉机，购自美国Matrx有限公司；QIAamp DNA Stool Mini kit，购自QIAGIN公司；Illumina Miseq高通量测序平台，购自美国Illumina公司。

2 方法

2.1 Balb/c小鼠原位结肠癌移植瘤模型

取对数生长期的CT26.WT结肠癌细胞，以1×106个细胞0.1 ml注射于2只Balb/c小鼠右侧腋下。21 d后，将2只小鼠处死后剥取瘤体，在0.9%氯化钠溶液中切成1×1×1 mm的瘤块。经气体麻醉后，用约50ul组织胶水将瘤块种植于距盲肠2～3 cm的结肠上，避免穿孔和黏连，共种植12只Balb/c小鼠。

2.2 分组及给药

种瘤后第2天将12只Balb/c小鼠分为2组，每组6只。化疗组腹腔注射奥沙利铂5 mg/kg，隔日1次[7]，腹腔注射5-氟尿嘧啶25 mg/kg，隔日1次。如第1天给予5-FU则第2天给予L-OHP，循环7次。化疗联合中药组在化疗组的基础上每天灌胃给予健脾固肠方颗粒剂14.43 g/kg，健脾固肠方颗粒剂共给予14次。

2.3 取材

给药14 d后脱颈处死12只小鼠，取出盲肠内容物置于-80 ℃冰箱待检。距离盲肠约3 cm取小肠组织，将其切成厚度约0.2～0.3 cm，大小为1.5×1.5×0.3 cm的组织块，置于4%中性甲醛中固定24～48 h。

2.4 检测

2.4.1 病理检测 将固定后的组织使用流水进行清洗，分别使用不同浓度梯度的乙醇进行脱水，使用二甲苯进行透明处理，将组织进行石蜡包埋，使用切片机将其切成4～7 μm薄片，使用二甲苯进行脱蜡，随后使用不同浓度梯度的乙醇进行水化，使用苏木素、伊红进行染色并显微镜下观察。小肠肠黏膜损伤程度的判断方式根据Chiu氏6级法进行评分：正常的肠黏膜绒毛评为0级，小肠绒毛顶端上皮下隙出现增大评为1级，上皮层和固有层出现中度分离评为2级，绒毛两侧出现大量分离伴随部分绒毛顶端破损评为3级，绒毛出现破损并伴固有层毛细血管暴露评为4级，固有层出现破坏、出血及溃疡评为5级。

2.4.2 菌群的检测和分析 室温融化粪便样品，准确称取200 mg样本，将其置于1.5 ml EP管中，加入1 ml PH=7.4 PBS缓冲液，充分涡旋震荡，13000 r/min离心2 min，去上清后收集沉淀，如上反复2次操作后将沉淀溶于TE溶液中。QIAamp DNA Stool Mini kit试剂盒提取过程严格按照试剂盒说明书。以上述提取的DNA作为模板进行16S rRNA 的PCR扩增。扩增所需条件：98℃30 s预变形，98℃10 s，50℃30 s，72℃30 s，重复20个循环；最后以72℃7 min延伸，产物保存在4 ℃冰箱，并将产物置于Illumina Miseq进行高通量测序。

使用生物信息学方法进行分析，该方法主要是基于OTU进行的分析，Simpson指数主要用来估算样品中微生物多样性的指标，Simpson指数越高表明微生物多样性程度越高。

2.5 统计学方法

3 结果

3.1 使用Chiu氏6级评分结果

图1表1示，化疗组与化疗联合中药组比较发现，化疗联合中药组肠道损伤更低，差异有统计学意义(P=0.044)。化疗组有2例出现绒毛破损并伴固有层毛细血管暴露(4级)，2例3级和2例2级；而化疗联合中药组损伤程度更轻，3例仅出现上皮层和固有层中度分离(2级)，1例3级和2例1级。

表1 化疗组与化疗联合中药组肠黏膜损伤程度比较

图1 化疗组与化疗联合中药组肠黏膜损伤程度比较

3.2 2组菌群多样性比较

图2示，化疗组与化疗联合中药组Simpson指数比较，化疗联合中药组Simpson指数更高，差异有统计学意义(P=0.029)。

3.3 菌属差异比较

图3示，化疗组与化疗联合中药组比较，发现化疗联合中药组中的梭菌属(Clostridium)、毛螺菌属(Lachnospiraceae)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、变形杆菌属(Proteobacteria)等菌属明显增多，且与化疗组比较差异有统计学意义(P<0.001，P=0.001，P<0.01，P<0.01)。

图2 化疗组与化疗联合中药组多样性比较

图3 化疗组与化疗联合中药组菌属差异比较

3.4 代谢通路

图4示，化疗联合中药组与化疗组比较，发现菌群毒素的代谢和脂肪酸的生物合成等通路差异有统计学意义(P≤0.029、P=0.045)。

图4 中药可能的代谢通路

4 讨论

据报道，化疗所导致的胃肠道毒副反应发生率达到70%～95%[7]。化疗不仅会严重损伤化疗敏感组织，还会诱发肠道炎症反应的发生，破坏肠道菌群的平衡和肠道屏障的完整等，引起二胺氧化酶、D-乳酸水平的升高。前期临床试验证明，健脾固肠方能降低化疗后二胺氧化酶、D-乳酸水平，二胺氧化酶能够反映肠黏膜细胞的完整性，D-乳酸能够体现肠黏膜损伤程度。肠黏膜严重损伤时可发生患者脱水、水电解质紊乱甚至出现死亡。化疗所导致的肠黏膜损伤会干扰化疗的进程，导致化疗剂量的减少和强度的减低，甚至是停药情况的发生，进而导致患者的预后变差[8]，健脾固肠方能够下调两者的水平，本次实验通过病理结果证明其能够缓解肠黏膜损伤程度。

现代医学证实，肠道的正常菌群起到促进消化吸收、刺激免疫力和防治疾病的作用。故我们认为，正常肠道菌群是中医后天之本脾脏的物质基础，是气血生化的源头[9]。健脾固肠方为钟薏的自拟方，临床用以治疗化疗所导致的肠道炎症反应。该方以四君子汤作为底方，其中党参具有补益脾胃之气、益胃生津的作用。现代研究表明，其具有抑制消化道溃疡、保护肠道黏膜完整性和调整胃肠功能等作用，其可能的机理为增加肠道内乳酸杆菌的数量以及降低大肠杆菌的丰度[10]。党参的有效成分为党参炔苷、党参多糖和毛果芸香碱等[11]；白术具有补益脾胃之气、利水化湿作用，现代研究表明其具有调节胃肠功能运动的作用[12]，其可能的机理为增加双歧杆菌和乳杆菌的数量以及降低肠杆菌的丰度[13]。白术的有效成分为白术挥发油、白术多糖等[14]；茯苓具有健脾利水化湿的作用，现代研究表明其具有缓解肠道微循环障碍的作用[15]，其可能的机理为升高双歧杆菌水平[11]，茯苓的有效成分为茯苓酸、茯苓总三萜等[16-17]；甘草具有补益脾胃之气、清热解毒作用，现代研究表明具有促进肠道黏膜愈合、抑制肠道炎症反应等作用[18]，其可能的机理为改变肠道菌群结构[19]，甘草的有效成分为甘草三萜皂苷类、甘草黄酮类等。

化疗药物会打破肠道的菌群状态，表现为菌群的失调和共生菌数量的减少，进而导致肠道黏膜的损伤和炎症的发生[20-21]。主流观点认为，菌群结构的调节尤其是补充短链脂肪酸产生菌的丰度能够治疗消化道疾病。2018年上海交通大学赵立平筛选出普拉梭菌属、毛螺旋菌属、真杆菌属、瘤胃球菌属、梭菌属、乳酸杆菌属、双歧杆菌属、变形杆菌属为短链脂肪酸产生菌，并明确了其中的15个株型[22]。健脾固肠方能增加化疗后的菌群多样性，提高梭菌属、毛螺菌属、双歧杆菌属、变形杆菌属等丰度，而这几种菌属均为短链脂肪酸产生菌。而之后通过菌群结果推测的代谢通路结果同样提示，健脾固肠方能够加速菌群毒素的排泄，加快脂肪酸的生物合成。故推测健脾固肠方可能通过提高短链脂肪酸产生菌的丰度，进而加速菌群毒素的排泄和加快脂肪酸的生物合成，最终缓解肠道炎症反应。

综上所述，健脾固肠方能减轻肠癌小鼠化疗后肠道炎症反应,其机制可能是通过提高短链脂肪酸产生菌的丰度, 进而加速菌群毒素的排泄和加快脂肪酸的生物合成，最终缓解肠道炎症反应。