日本结缕草修剪后防御响应的分子机制

何旭升， 徐志高， 刘敏杰

(国家林业和草原局中南调查规划设计院，长沙 410014)

机械损伤胁迫诸如修剪、践踏等在自然界中普遍存在，也是植物在其生命周期中不可避免的一种非生物胁迫。为了应对这样的胁迫环境，植物已经进化出了一套完整的应激响应机制，来抵御受创伤后的一系列不利因素。目前植物应对机械损伤胁迫防御响应机制的研究主要在拟南芥(Arabidopsisthaliala(L.) Heynh)等模式植物中进行[1]。研究发现，植物创伤伤口的周围会产生大量的活性氧(Reactive Oxygen，ROS)类物质[2]，这些ROS类物质能够与植物激素相互作用，从而影响下游的防御信号因子来调控相应的防御响应[3]。现有研究表明，ROS能够通过促进重要的防御类植物激素脱落酸(ABA)的生物合成，以及抑制ABA的降解，使得植物内源ABA水平升高。而ABA又能促进植物保卫细胞产生ROS类物质，因此植物在受到机械损伤胁迫后会产生ROS类物质和植物激素ABA之间的正反馈调节，从而介导植物气孔的关闭，增强植物的防御[4-5]。此外，研究人员还发现ABA能够通过促进另一种重要防御类植物激素茉莉酸(JA)的生物合成来激活植物防御响应[6]。

植物激素JA是公认的植物应对机械损伤胁迫重要的信号物质， 植物创伤会导致植物内源JA水平的升高，从而促进防御反应的信号转导过程，以此激活植物的防御响应[7]。研究发现，当番茄叶片受到机械损伤时，其内源JA水平升高，同时JA介导的信号转导基因和下游的防御基因也在数小时内被激活[8-9]。另外，JA以及其信号转导途径也是植物抵御昆虫或食草类动物所必须的，而具有JA合成缺陷或对JA信号有感知缺陷的拟南芥突变体，更易遭受昆虫的袭击[10-11]。最新的研究表明，JA还可以抑制植物生长相关基因的表达，从而抑制参与植物生长和代谢(光合作用)相关酶的合成，使植物可以将更多的资源用于防御响应[12]。因此，植物激素ABA和JA在植物应对机械损伤胁迫的过程中发挥着重要的作用。

日本结缕草(Zoysiajaponica)是禾本科多年生暖季型草坪草，因具有优良的耐修剪和践踏的特性，广泛应用于运动场草坪和园林绿化。日本结缕草这个特性也使它成为研究禾本科草地植物修剪后防御响应机制的理想材料，但是目前对其这一方向的研究还很少。为了探究日本结缕草修剪后防御响应的分子机制，本研究对日本结缕草品种“Zenith”在修剪后0，2，6 h和24 h四个时间点，创伤叶片的过氧化氢(H2O2)含量及细胞膜透性进行检测，以探究其叶片创伤程度随时间的变化。同时通过对内源JA和ABA水平的检测，以及这两种植物激素信号转导途径四个关键基因相对表达量的检测，来探究JA和ABA对修剪后日本结缕草防御响应的影响。为提高禾本科草地植物的耐修剪和抗践踏性能提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1)植物材料。日本结缕草(Zoysia japonica)品种“Zenith”，由美国Hancock种子公司(Hancock Seed Inc)提供。盆栽种植于室内，所用基质为泥炭∶蛭石∶砂=2∶2∶1，温度25 ℃，相对湿度50%～70%。将生长至两个月的未分蘖植株用剪刀修剪至4 cm高，分别在修剪后的0，2，6 h和24 h四个时间点进行取样(0为刚修剪完取样，作为对照)。每个时间点三次重复，取样部位为叶片部分，所取样品立即用液氮速冻处理后放-80 ℃保存。

2)试剂。Eastep Super总RNA提取试剂盒(Invitrogen，China)，M-MLV反转录酶(Promega， USA)，荧光定量试剂购自北京全式金公司的TranScriptⅡ Green one-Step qRT-PCR SuperMix、Tip Green Qpcr SuperMix。

3)仪器 。NanoDrop2000超微量分光光度计(Thermo Fisher Scientific，USA)，PCR仪(Biometra，German)，ABI stepone实时荧光定量PCR仪(ABI，USA)。

1.2 方法

1.2.1 过氧化氢水平和细胞膜通透性的测定

利用3，3'-二氨基联苯胺染色法(DAB染色法)测定叶片伤口处的过氧化氢含量，每个图片代表了超过10个样品在每一个时间点(修剪后0， 2， 6h和24 h)的三个独立实验中的染色情况。

参考王学奎的方法对叶片进行相对电导率的测定[13]，以此来检测受伤叶片的细胞膜透性。每个时间点3次重复。

1.2.2 植物激素水平测定

采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)分别测定修剪后日本结缕草叶片内源ABA和JA的含量。具体操作步骤参考ELISA试剂盒说明书，根据说明书的计算公式以及稀释倍数可计算出植物激素水平。

1.2.3 RNA提取及反转录

取50～100 mg冷冻样品用液氮研磨，随后依照Eastep Super总RNA提取试剂盒说明书的方法进行RNA的提取。得到的样品RNA经由经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，用NanoDrop2000 超微量分光光度计测其浓度及OD260/OD280。最后采用M-MLV反转录酶对RNA进行反转录，反转录方法参照试剂盒操作方法，得到的反转录产物经Actin[14]检测后稀释至200 ng/μL[15]。

1.2.4 引物设计

从已发表的日本结缕草基因组数据库[16]中获得ZjCOI1、ZjMYC2、ZjPP2C和ZjSNRK2四个基因的保守序列，然后用primer 5.0软件进行引物设计。

ZjCOI1基因引物序列为：上游引物5' ATCTTACTCCTGCCCTTTGGAAACA 3'，下游引物5' GCTGTAGCGGAGGTGTAGTGAAATA 3'；

ZjMYC2基因引物序列为：上游引物5' ATGCAATGCGTGCTTAATCATACT 3'，下游引物5' CGATACCGTTACTCTTACCCACCT 3'；

ZjPP2C基因引物序列为：上游引物5' TTGTCACTGGCTGTTCACCAAACC 3'，下游引物5' TGTGATGTAGCACGCAAACGGATA 3'；

ZjSNRK2基因引物序列为：上游引物5' CGTATCTTTGTTGCCAATCCTGC 3'，下游引物5' TTATCGTATTCACCTTCCTCGTT 3'。

1.2.5 普通PCR

利用引物设计软件设计的引物进行普通PCR扩增，反应体系50 μL，一次加入Tag酶Mix 5 μL，上下游引物各1 μL，样品RNA 1 μL，去离子水2 μL。反应程序为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35次循环；最后72℃延伸5 min，12 ℃保温。

1.2.6 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)

采用ABI stepone 荧光定量PCR仪进行进行基因的相对表达量检测，参照北京全式金公司的试剂盒TranScriptⅡ Green one-Step qRT-PCR SuperMix的操作步骤进行上机反应。每个样品4个重复，结果采用2-△△CT算法进行基因相对表达量的量化分析[17]。

1.2.7 数据分析

所有数据均采用Microsoft Office Excel 2003与SPSS V19.0软件进行数据整理及差异性分析。

2 结果

2.1 创伤叶片过氧化氢含量和细胞膜透性

机械损伤会破坏植物细胞膜的结构，同时会导致活性氧类物质过氧化氢(H2O2)在伤口处聚集[18]。通过对修剪后的日本结缕草叶片进行DAB染色和相对电导率(EL)的检测，来判定伤口处的H2O2含量和细胞膜结构完整性。

试验结果显示，H2O2在创伤部位迅速的积累(图1)。修剪后的0， 2， 6 h和24 h的创伤叶片中，0时点(图1A)的染色程度最高，在2 h(图1B)下降，在6 h和24 h(图1C和1D)的H2O2染色水平最低，表明创伤叶片的H2O2水平在修剪后爆发然后逐渐下降。细胞膜透性的试验结果显示，0时点创伤叶片的细胞膜透性显著高于其它三个时间点(P<0.05，图2)，这表明细胞在修剪后的0时点损伤最严重；在2 h时，EL明显下降，但仍高于6 h和24 h的水平(P>0.05)；而6 h和24 h两个时间点的EL水平无显著差异(P>0.05)。细胞膜透性的结果与DAB染色结果一致，呈先爆发后下降至平稳的趋势。上述试验结果表明，修剪后的创伤叶片细胞在0时点受伤最为严重，在修剪后的6 h内逐渐恢复，24 h无明显变化。

图1 创伤叶片的DAB染色

图2 创伤叶片的相对电导率(EL)注：***指 P<0.001

2.2 创伤叶片内源JA和ABA水平

植物应对机械损伤胁迫的防御响应受到多种因素的影响，植物激素在这一过程中发挥着重要作用，机械损伤会导致植物的JA和ABA水平显著的变化[19-20]。

因此，本研究对修剪后日本结缕草叶片中的JA和ABA含量进行了检测，试验结果如图3。修剪后叶片的JA含量没有显著变化(P>0.05)(图3A)。但是ABA的水平随着时间的推移发生了显著的变化，在修剪后2 h和24 h 的ABA水平要显著高于修剪后6 h的ABA水平(P<0.05)(图3B)，0时点和其他时间点的ABA水平没有显著差异(P>0.05)。表明，两种植物激素在修剪后日本结缕草叶片中表现出不同的变化趋势，JA变化相对平稳，而ABA水平在0～24h内呈动态变化。

图3 修剪后日本结缕草叶片的JA和ABA水平注：*指P<0.05， **指P<0.01。

2.3 创伤叶片JA和ABA信号转导基因相对表达量情况

为了进一步探究植物激素JA和ABA在修剪后日本结缕草防御响应中的作用，本研究利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分别测量了修剪后0， 2， 6 h和24 h的JA和ABA信号转导途径中关键基因的相对表达量，结果如图4。

图4 损伤过程中激素信号转导相关基因的表达注：*指P<0.05， **指P<0.01， ***指P<0.001。

COI1(Coronatine-insensitiveprotein1)是JA信号转导途径的关键基因，COI1能促进信号因子MYC2的释放，以此来激活JA信号转导途径，被释放的转录因子MYC2进而能够调控下游防御基因的表达，使植物产生防御应答[21-22]。在修剪后的日本结缕草叶片中，ZjCOI1基因和ZjMYC2基因在2， 6 h和24 h三个时间点的表达量都显著上调(P<0.05)(图4A)。

PP2C和ZjSNRK2是ABA信号转导途径中两个关键基因，PP2C能够通过去磷酸化作用来抑制ZjSNRK2，从而抑制ABA信号通路[23]。当日本结缕草被修剪后，ZjPP2C在三个时间点显著下调(P<0.05)，而ZjSNRK2在2 h和6 h时显著上调(P<0.05)，但在24 h的表达水平与0时点无显著区别(P>0.05)(图4B)。表明，两种与植物防御相关的植物激素JA和ABA的信号大多在2， 6 h和24 h激活。

3 讨论

机械损伤胁迫会诱导植物产生多种防御响应，其中ROS的爆发是最广为人知的。ROS是植物在遭受胁迫后产生的一种特殊的物质，能够作为一种信号因子，传递胁迫信号从而引起系统的防御应答[24]。本研究试验结果显示，受伤的叶片在0时点的染色程度最高，在2 h时开始下降，6 h和24 h时的染色水平达到最低，这样的结果表明在修剪后的日本结缕草叶片中出现了ROS的爆发，随后细胞又产生了ROS的消除反应。

研究表明，ROS能够促进ABA的生物合成或抑制ABA降解，导致细胞内游离ABA水平升高[5，25]。ABA是植物应对外界胁迫的重要植物激素，主要参与植物的渗透调节、病害预防等[26]。还有一些研究表明，ABA介导的MAPK信号通路能够诱导CAT1(Catalase)基因的表达，从而抑制H2O2的水平[27]。从本研究ABA水平的变化中可以看出，日本结缕草创伤叶片的ABA水平在6 h时出现下降趋势，但并没有与创伤叶片的H2O2一样呈现持续的下降，而是在24 h时又出现上升。据此推测在日本结缕草中也存在ROS爆发所诱导的ABA的生物合成过程以及ABA介导的H2O2抑制过程。同时，应该还存在另外的机制来诱导叶片中已经下降的ABA水平在24 h又重新上升。植物激素ABA的信号转导途径在受伤的日本结缕草中也起着重要的作用。qRT-PCR结果表明，ABA信号在6 h时更加活跃。研究表明，ABA可以通过胼胝质的合成来提高植物防御[28]。结合本研究之前创伤叶片H2O2和细胞膜透性的结果，可知在修剪后的日本结缕草中也存在该防御过程。

植物激素JA在植物应对机械损伤胁迫的过程中发挥着至关重要的作用，JA信号转导途径和防御基因会在受到创伤后的几小时内被系统性的激活[8-9]。另外，JA以及其信号转导途径也是植物抵御昆虫或食草类动物所必须的[10-11]。本研究的试验结果表明，创伤叶片的内源JA水平在6 h都保持较高水平；JA信号转导途径在6 h时更加活跃。这些结果与前人的研究结果一致，因此可知在修剪后的日本结缕草中也存在JA信号转导途径参与的抵御外界昆虫啃食的防御响应。

综上所述，JA和ABA通过其信号转导途径参与了日本结缕草修剪后的防御响应，可能通过消除创伤叶片处的H2O2、修复创伤叶片伤口以及抵御食草昆虫侵袭等途径来激活和增强植物的防御响应。本文初步探究了日本结缕草修剪后防御响应的分子机制，证明了植物激素JA和ABA在日本结缕草应对机械损伤胁迫的防御响应中发挥了重要作用，为提高禾本科草地植物耐修剪和抗践踏性能提供了理论基础。