大气颗粒物PM2.5对老年雄性大鼠骨代谢的影响

张宝玉 尹瑞梨 莫彩艳 赵冬 马燕 柯静

[摘要] 目的 觀察大气细颗粒物PM2.5对老年雄性大鼠骨密度、骨小梁结构的影响，及对核因子κ受体激活剂Β配体（RANKL）/骨保护素（OPG）表达的作用，探讨PM2.5对老年大鼠骨代谢的影响。 方法 采用雾霾仓暴露系统，按照随机数字表法将20只19月龄老年SD雄性大鼠分为清洁组和PM2.5组，每组10只。将其分别饲养于清洁仓和雾霾仓，每周监测体重，12周后，取材留取股骨组织，检测大鼠骨密度。苏木精-伊红（HE）染色观察骨组织形态;提取骨髓中的mRNA，应用Real-time PCR检测RANKL/OPG的表达情况。 结果 两组体重随着时间的延长呈现稳定的增高，但两组体重比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。HE结果显示，与清洁组比较，PM2.5组松质骨部位的骨小梁减少，排列稀疏、部分断裂。与清洁组比较，PM2.5组骨密度、骨小梁数量、骨小梁面积和骨小梁面积百分比均明显下降，差异均有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。Real-time PCR结果显示，与清洁组比较，PM2.5组骨髓中的OPG mRNA含量降低，而RANKL mRNA含量增高，差异均有统计学意义（均P < 0.05）。 结论 长期暴露于PM2.5中有可能通过增加成骨细胞RANKL表达并降低OPG表达，增加破骨细胞活性，进而降低骨密度和骨小梁，加重老年大鼠骨质疏松。

[关键词] 骨代谢;PM2.5;大鼠;核因子κ受体激活剂B配体;骨保护素

[中图分类号] R2          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2020）05（c）-0004-04

Effects of atmospheric particulate matter PM2.5 on bone metabolism in aged male rats

ZHANG Baoyu*   YIN Ruili*   MO Caiyan   ZHAO Dong   MA Yan   KE Jing

Center for Endocrine Metabolism and Immune Diseases， Beijing Luhe Hospital， Capital Medical University， Beijing   100149， China

[Abstract] Objective To observe the effect of atmospheric fine particulate matter PM2.5 on bone mineral density and trabecular structure of aged male rats， and the effect of receptor activator of nuclear factor-kappa B ligand （RANKL）/osteoprotegerin （OPG） expression of function， and to explore PM2.5 effect on bone metabolism of aged rats. Methods A total of 20 male SD rats aged 19 months were divided into the cleaning group and the PM2.5 group according to the random number table method using a haze warehouse exposure system， with 10 rats in each group. They were kept in a clean warehouse and a haze warehouse respectively， and their weight was monitored weekly. After 12 weeks， femoral tissue was collected and bone mineral density of rats was detected. Bone morphology was observed by hematoxylin-eosin （HE） staining. The mRNA in bone marrow was extracted and the expression of RANKL/OPG was detected by Real-time PCR. Results The body weight of the two groups increased steadily with the extension of time， but there was no signifant difference in body weight between the two groups （P > 0.05）. HE results showed that compared with the cleaning group， the bone trabeculae in the cancellous bone of the PM2.5 group were reduced， arranged sparsely and partially fractured. Compared with the clean group， bone mineral density， trabecular number， trabecular area and percentage of trabecular area in the PM2.5 group all decreased significantly， with statistically significant differences （P < 0.05 or P < 0.01）. Real-time PCR results showed that compared with the clean group， OPG mRNA content in the PM2.5 group was decreased， while RANKL mRNA content was increased， with statistically significant differences （all P < 0.05）. Conclusion Long-term exposure to PM2.5 may increase osteoclast activity by increasing the expression of osteoblasts RANKL and decreasing the expression of OPG， thereby reducing bone mineral density and bone trabeculae and aggravating osteoporosis in aged rats.

[Key words] Bone metabolism; PM2.5; Rats; Receptor activator of nuclear factor-kappa B ligand; Osteoprotegerin

骨质疏松症是老年人常见病，以骨量减少、骨微细结构破坏，导致骨脆性增加和骨折风险增高为特征的代谢性骨疾病[1-2]。骨质疏松症及其相关性骨折导致绝经后妇女和老年男子肢体功能丧失、生活质量下降，严重者甚至导致死亡[3-4]。2018年中国骨质疏松症流行病学调查显示[5]：我国50岁以上人群骨质疏松患病率达到19.2%，50岁以上女性患病率为32.1%。骨质疏松症多数是由于骨形成和骨吸收过程出现动态失衡引起，随着年龄的增长、性激素水平的降低，成骨细胞活性逐渐降低，使得破骨细胞活性相对增强，导致骨吸收大于骨形成，造成骨量减少[6-7]。除了传统危险因素，我们需要探讨新的危险因素来预防骨质疏松的发生。

随着工业化和城市化的快速发展，空气污染已经成为一个严重问题，各种空气污染物威胁着人类健康。空气动力学直径2.5 μm的细颗粒物称为PM2.5，其是影响人类健康的最重要因素[8]。PM2.5暴露会增加心脏病和脑卒中、肺癌、慢性肺病和呼吸道感染等死亡风险。韩国对40～59岁男性工人进行的一项横断面研究发现骨密度与烟雾的暴露呈负相关[9]。有研究显示PM2.5浓度高的地区，骨折住院风险升高[10-11]，PM2.5暴露与骨质疏松和骨量减少相关[12]。PM2.5易附带有毒、有害物质比如多环芳烃类化合物，这些有毒物质可随呼吸通过肺泡进入毛细血管，再进入整个血液循环系统，引发炎症和氧化损伤反应，进而可能影响骨健康，尤其是老年人[13]。PM2.5对于骨健康影响的具体机制还有待于探讨。本研究将老年雄性大鼠分别暴露于雾霾仓和清洁仓中，检测大鼠股骨骨髓RANKL/OPG mRNA的表达，从基因分子和形态学水平探究PM2.5对骨代谢的影响机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验动物为20只清洁级老年雄性SD大鼠，19月龄，体重为（500±10）g。SD大鼠均购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物生产许可证号为SCXK（京）2016-0006，编号为1100112011004775，本动物实验已经通过首都医科大学动物伦理委员会审查。医学实验动物饲养环境设施为首都医科大学附属北京潞河医院中美神经生物研究所。引物合成购自生工生物工程（上海）股份有限公司;逆转录试剂盒iScriptTM Reverse Transcription Supermix（生产批号：1708 840）和iTaqTM universal SYBR？誖 Green supermix（生产批号：64226900）购自美国BIO-RAD公司;

1.2 动物实验及分组

20只大鼠按照随机数字表法将其分成PM2.5组和清洁组，每组10只。PM2.5组暴露于雾霾仓中，而清洁组暴露于清洁仓中。暴露时间为2018年8月16日～2018年11月8日。雾霾仓使用的是一个“真实”的PM2.5暴露系统，该系统是由Sioutas开发的“多用途气溶胶浓度浓缩系统”（VACES）改进[14]，并经过Chen和Nadziejko的修改而来的[15]。由于富集系统比较昂贵且北京颗粒物污染严重，因此，该系统没有设置浓缩装置，而是模拟“真实环境”的PM2.5暴露系统，模拟大气环境中颗粒物与污染气体的协同作用。实验中的清洁仓则是将高效颗粒空气过滤器放置在进气阀位置，以去除过滤后的气流中的所有PM2.5。大鼠在暴露期间自由进食和饮水，并在温度（22±2）℃和相对湿度40%～60%的条件下进行12 h/12 h的光暗循環。

1.3 实时荧光定量PCR（Real-time PCR）

提取骨髓细胞中总RNA，根据BIO-RAD试剂盒说明书进行实验操作，将总RNA逆转录成cDNA，每个基因的反应体系按照试剂盒的说明书进行Real-time PCR实验操作。以β-actin为内参基因，根据△Ct值，按照公式2-△△Ct表示目的基因的相对表达量。逆转录体系为4 μL的5×Traniscript Supermix，14 μL的Nuclease-free water和2 μL RNA。Real-time PCR反应体系为10 μL SYBR Green supermix，0.4 μL 10 μmol/L引物，1 μL双蒸水和8.2 μL cDNA。扩增条件为：94℃10 min，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，35个循环，72℃ 5min。

引物序列：核因子κ受体激活剂Β配体（receptor activator of nuclear factor-kappa B ligand，RANKL）正向引物5′-ACCAGCATCAAAATCCCAAG-3′，反向引物5′-TTTGAAAGCCCCAAAGTACG-3′;骨保护素（osteoprotegerin，OPG）引物：正向引物5′-GTTCTTGCACAGCTTCACCA-3′，反向引物5′-AAACAGCCCA-GTGACCATTC-3′;内参序列β-actin：正向引物5′-CGTAAAGACCTCTATGCCAACA-3′，反向引物5′-CG-GACTCATCGTACTCCTGCT-3′。

1.4 形态学检测

将所有大鼠左侧股骨组织小心分离，用10%的多聚甲醛溶液固定24 h，进行脱钙处理，石蜡包埋，病理切片。苏木精-伊红（HE）染色切片，使用3D HISTECH Pannoramic 250（Hungary）对切片进行扫描，Case Viewer软件（Hungary）进行截取视野，用Image-pro plus 6.0（Media Cybernetics，Inc.，Rockville，MD，USA）对骨小梁面积和数量进行统计。采用双能X线骨密度仪，分别测量大鼠骨组织中骨密度的含量。

1.5 統计学方法

采用SPSS 22.0统计学软件对所得数据进行分析，计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，采用t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠暴露期间雾霾仓和天气预报的PM2.5浓度比较

实验期间，北京市天气预报的雾霾浓度和雾霾仓通过PM2.5粒子检测系统检测记录的结果相一致。见图1。

2.2 暴露期间SD大鼠的体重变化

两组体重随着时间的延长呈现稳定的增高，但两组体重比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见图2。

2.3 SD大鼠骨组织的形态学观察

与清洁组比较，PM2.5组松质骨部位的骨小梁减少，排列稀疏、部分断裂。见图3。与清洁组比较，PM2.5组骨密度、骨小梁数量、骨小梁面积和骨小梁面积百分比均明显下降，差异均有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。见表1。

2.4 Real-time PCR检测SD大鼠骨髓中的OPG和RANKL mRNA表达水平比较

与清洁组比较，PM2.5组骨髓中的OPG mRNA含量降低，而RANKL mRNA含量增高，差异均有统计学意义（均P < 0.05）。见表2。

3 讨论

本研究采用老年SD大鼠进行研究，利用全身雾霾暴露系统，实时监测空气中PM2.5，结果显示老年大鼠松质骨部位的骨小梁减少，排列稀疏、部分断裂。同时，PM2.5组骨密度、骨小梁数量、骨小梁面积和骨小梁面积百分比均低于清洁组，提示长期暴露于PM2.5中可以降低骨密度和骨小梁，加重老年大鼠骨质疏松。该结果与临床研究相符合。Prada等[10]做了两项独立的临床研究，发现空气颗粒物污染与长期骨丢失和骨折风险相关，特别是老年人以及经济不发达地区。Mazzucchelli等[11]探讨发现室外空气污染与骨质疏松性髋部骨折之间存在短期关联。

PM2.5引起骨质疏松的作用机制尚不完全清楚。PM2.5作为雾霾中的主要颗粒，由于粒径小，相对表面积大，易富集多环芳烃等特点，可以随着人的呼吸进入体内导致心血管和呼吸等系统疾病。长期暴露于PM2.5引起的氧化性损害和炎性反应，可能影响骨骼健康[10]。本研究检测了大鼠骨髓组织中RANKL mRNA、OPG mRNA的表达水平，结果显示，与清洁组比较，PM2.5组骨髓中的OPG mRNA含量降低，而RANKL mRNA含量增高，差异均有统计学意义（均P < 0.05）。提示长期暴露于PM2.5中可增加RANKL表达并降低OPG表达。成骨细胞表达并释放RANKL，与破骨前体细胞膜上RANK结合，启动破骨细胞生成基因的转录，最终诱导成熟的破骨细胞形成。成骨细胞分泌的OPG以二聚体形式，竞争性地与三聚体RANKL结合，使其失去结合RANK的活性，从而使破骨细胞的生成受到抑制[16-18]。本研究PM2.5组OPG含量降低而RANKL含量增高，会诱导更多的成熟破骨细胞。PM2.5可能通过影响RANKL/RANK/OPG信号通路，影响骨代谢，引起骨量减少甚至导致骨质疏松症。

随着人群的老化，骨质疏松性骨折的全球患病率正在逐渐增加[19-20]。为了减少骨质疏松及骨质疏松骨折的发生，需要有效预防措施，除了控制传统危险因素，如增加运动量、减少烟酒摄入、减少可能影响骨代谢药物等。控制空气污染，可能成为预防骨质疏松及其相关骨折的一项新措施。

本研究的不足之处包括雾霾仓系统没有浓缩装置且不能控制PM2.5的浓度，但是可以模拟“真实环境”的PM2.5暴露系统，更可以反映真实世界的情况。其次，没有检测大鼠血清中骨转换标志物，不能全面评估骨代谢情况。

总之，本研究提示长期暴露于PM2.5中可能通过调节RANKL/OPG信号通路的表达，诱导产生更多破骨细胞，进而影响老年骨质疏松的发生发展，详细作用机制值得进一步的研究探讨。

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（收稿日期：2020-02-14  本文編辑：顾家毓）