益生菌检测在食品微生物实验教学中的应用

刘丽艳，王 文，苏健裕

(华南理工大学轻工与食品实验教学中心，食品科学与工程学院，广东 广州510640)

0 引言

食品微生物学是一门具有较强实验性的专业基础课，对于培养食品领域人员的食品微生物检验技术、食品质量控制能力及卫生安全意识具有重要意义。“微生物学实验”是微生物学教学不可分割的一部分，同时也是所有食品和生命科学研究的实验基础。现有的实验教学，重点培养学生掌握单项实验技能和熟练实验操作，如细菌染色及显微观察、霉菌菌种培养及观察、酵母计数和大小测定等，较好地完成了理论课知识的验证。但由于实验课学时、实验内容安排顺序和关联性等因素限制，课程结束后学生对科学研究的认知度仍然欠缺，理论联系实际的能力不足，所以需要开展结论未知的综合型探索性实验，把食品微生物实验课程各单项整体应用起来，增强各单项之间的关联性，设计贴近日常生活的实验题目[1]。在保障本科生掌握微生物基本实验技能的基础上，帮助学生从学习单项实验操作，发展为从文献检索和实验设计到团结协作完成实验。从而不断提高本科生的实验技能和提升对实验整体性和系统性的宏观认知，激发本科生实验兴趣，以培养出既具有扎实理论基础，又有较高实验技能和实验创新能力的食品领域工作者[2-3]。

目前，益生菌已广泛用于乳制品行业[4-5]。该文从实验教学内容选择、教学过程管理和完善考核制度等方面探讨和总结探索性实验项目在食品微生物学本科实验课上的应用，为食品微生物学实验教学体系更新提供一些思路，供同类课程交流和探讨。

1 发酵奶制品中益生菌检测实验

1.1实验目的

掌握灭菌、梯度稀释和不同食品中微生物的测定、分离、接种、培养及菌落计数等操作。完成市售发酵饮料产品中乳酸菌的检测，对市售发酵奶制品中乳酸菌的活菌含量有所了解。

1.2仪器与试剂

材料：供试发酵奶制品，市售益生菌饮料均可。

仪器：灭菌锅、恒温振荡摇床、培养箱、天平、均质器、恒温水浴箱、移液枪及配套枪头、500 mL锥形瓶、培养皿、菌落计数器、放大镜、具塞试管和接种环等。

1.3实验步骤及内容设计

1.3.1样品稀释

(1)在超净工作台内，以无菌移液器移取25 mL样品置于已灭菌的盛有225 mL生理盐水的锥形瓶中(瓶内预装一定数目的无菌玻珠)，摇匀，得到1∶10的样品稀释匀液。

(2)用移液器移取1 mL已稀释成1∶10的样品匀液，沿管壁缓缓注入已灭菌的盛有9 mL稀释液的试管中(注意吸头尖端避免触及液面)，摇匀，得到1∶100的样品稀释匀液。

(3)依照以上操作步骤，制备一系列10倍梯度的稀释样品匀液，每递增稀释一次均更换无菌吸头。

1.3.2乳酸菌总数测定

乳酸菌(Lactic acid bacteria)是可发酵利用糖类，并产生大量乳酸的一类细菌的通称。国标中检测的乳酸菌主要有双歧杆菌 (Bifidobacterium) 、嗜热链球菌 (Streptococcus) 和乳杆菌 (Lactobacillus)。

(1)双歧杆菌的计数。依据对待检样品中双歧杆菌可能含量的估计，选择连续的3个稀释度，每个稀释度吸取1 mL样品匀液于灭菌平皿内，每个稀释度做2个平皿。稀释液移入平皿后，将冷却至48 ℃的莫匹罗星锂盐和半胱氨酸盐酸盐改良的MRS培养基倾注入平皿约15 mL，转动平皿使混合均匀。在36 ℃下厌氧培养72 h后，对平板上的所有菌落进行计数。样品稀释和平板倾注的整个过程须在15 min内完成。

(2)嗜热链球菌的计数。依据对待检样品中嗜热链球菌可能含量的估计，选择连续的3个稀释度，分别吸取每一个稀释度的样品匀液1 mL置已于灭菌的平皿内，每一个稀释度均做2个平皿做为平行。先将稀释液加入平皿，再将已冷却至48 ℃的MC培养基约15 mL倾注进平皿内，平行转动平皿使稀释液与培养基混合均匀。在36 ℃下需氧培养72 h后计数。在MC琼脂平板上，嗜热链球菌的菌落特征是菌落为中等偏小的红色菌落，边缘整齐光滑，直径(2± 1 mm)，菌落背面呈现粉红色。样品稀释和平板倾注的整个过程须在15 min内完成。

(3)乳杆菌的计数。依据对待检样品中乳杆菌可能含量的估计，选择连续的3个稀释度，分别吸取每一个稀释度的样品匀液1 mL置已于灭菌的平皿内，每一个稀释度均做2个平皿做为平行。先将稀释液加入平皿，再将已冷却至48 ℃的MRS琼脂培养基约15 mL倾注进平皿内，平行转动平皿使稀释液与培养基混合均匀。(36 ± 1)℃厌氧培养(72 ± 2)h。样品稀释和平板倾注的整个过程须在15 min内完成[6]。

1.4实验结果

菌落计数以菌落形成单位(CFU)表示，可用肉眼或放大镜观察，记录稀释倍数和相应的菌落数量。

选取菌落数为30～300 CFU且菌落无蔓延生长的平板用于菌落总数计数。<30 CFU的平板可计算具体菌落个数，>300 CFU的平板可记录成“多不可计”。每一个稀释度的菌落总数需选取2个平板计数结果的平均值，再将此平均值乘以相应的稀释倍数，即为每g(mL)待测样品中菌落总数。如图1所示，2个平板稀释倍数均为10-7，则市售乳饮料中干酪乳杆菌的数量为1.3×109CFUmL。

如果连续2个稀释度的平板上菌落总量在适宜计数范围内，按式(1)计算。

(1)

式中N——待测样品中菌落总数

∑C——含适宜范围菌落数平板上的菌落数总和

n1——低稀释倍数的平板个数

n2——高稀释倍数的平板个数

d——稀释因子即低稀释倍数的稀释度

图2为市售饮料中嗜热链球菌平板计数实例，其中，平皿A稀释倍数10-5，平皿B稀释倍数10-6，则该市售饮料中嗜热链球菌数量为2.8×107CFUmL。

2 实验实施过程及时间安排

该综合型探索性实验过程分为3个阶段。

第1阶段：课前开展讨论并确定实验方案。教师在开始授课前2周布置实验项目，将项目名称、实验目的和意义、注意事项等发给学生。学生2人为一组，要求每个学生都要通过各种途径查阅文献资料，自行进行分析讨论，结合文献资料和已学过的实验操作初步确定实验方案，课前1周由教师组织课堂讨论，教师按照实验的可行性和准确性等要求对方案进行审查，并指出方案中存在的问题，学生进一步修订方案，教师课前检查并确定实验最终方案[7]。

第2阶段：实验实施过程。各小组根据已确定的实验方案，在现有实验室条件下开展实验。小组学生在实验过程中需相互合作，遇到困难时，小组学生先进行讨论并提出解决办法，再寻求教师帮助。在整个实验过程中，约3名教师随堂巡视，每位教师负责学生8～12人，规范学生的实验操作手法，避免或减少因实验操作不当而造成的人为误差，以提高实验结果的可靠性[8]。

第3阶段：实验结果总结与分析。实验完成后，学生观察实验结果，分析实验结果是否达到预期，并分析整个实验过程，总结经验教训，分析成败关键环节及实验操作要点，完成实验报告，教师按照对应的考核评价标准给出分数。

3 考核评价标准

实验课总成绩为100分，成绩组成和比例与传统验证性实验项目不同，进行了重新规划。其中，学习态度及团队合作占20%，实验操作占40%，实验报告占40%。学习态度及团队合作主要考察学生主动性、遵守微生物学实验室守则、按时提交预习报告和实验方案及实验过程中积极配合和团结协助情况。实验操作主要考察学生微生物学的基本操作技能，以及有关仪器设备的正确使用，由教师根据操作情况给予课堂评分[9-10]。实验报告内容及分值进一步细化到实验目的、实验原理概述、材料和仪器、实验内容及步骤、结果分析与讨论和思考题，其中，结果分析及思考题部分的分值占实验报告的50%。此评价方式更注重过程管理和侧重实验结果分析与学生的讨论思考环节，督促学生关注课前讨论、课上操作和课后分析的全过程。探索性实验课程的实施培养了学生的团队协作精神，训练学生设计、归纳并总结，提倡讨论与思考，学生发现问题、分析并解决问题的能力在此过程中得到较好的锻炼。

4 结束语

“发酵奶制品中益生菌的检测”实验项目所需时间不长且仪器设备简单，在本科实验教学中可以实现。该实验项目紧跟生活热点，在生产中应用广泛，学生非常感兴趣。通过把综合型探索性实验项目引入食品微生物学实验课，把传统的“以课程为中心”实验教学内容转移到“以问题为中心”的轨道上，学生通过探索性实验可以将理论课所学的知识点和实验课的操作单元有机结合，知识掌握更加深入和系统，锻炼本科生查阅文献和运用已掌握的食品微生物学基础知识及实操技能来解决生产实际问题的能力，使其能在未来的职业生涯中尽快适应社会。