人面果叶HPLC指纹图谱研究

吕贵萍　刘慧　陈玉　刘新桥　胡鑫　杨光忠

摘要：为建立人面果叶高效液相色谱（ HPLC）的指纹图谱，采用Agilent C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5μm），乙腈一甲醇一0.5%磷酸水溶液为流动相（梯度洗脱），在流速1.0 mL/min，柱温30℃，检测波长289nm，进样量10 μL的色谱条件下，以福木苷，GB2a.藤黄双黄酮，GBla，volkensiflavone为对照品，绘制了44批人面果叶HPLC图谱，通过相似度评价、主成分分析、聚类分析等3种方法对44批来源于不同产地、季节的人面果叶的指纹图谱进行了研究。结果表明：44批样品相似度在0.6～o.9之间，确定了11个共有峰，并指认其中4个峰，分别为福木苷、GB2a、藤黄双黄酮、GBla;不同批次人面果叶的指纹图谱均有一定差异，而且季节对人面果叶成分的影响大于产地的影响。该方法不仅可用于人面果叶的品种鉴别和质量评价，还可为下一步制定人面果叶的质量标准提供参考。

关键词：人面果叶;藤黄双黄酮;指纹图谱;主成分分析;聚类分析

中图分类号：R284 文献标识码：A 文章编号：1674-9944（2020） 2-0174-06

1 引言

人面果（Garcinia ranthochymus），又称大叶藤黄，为我国传统傣药，是藤黄科（Guttiferae）藤黄属（Garcin-ia）植物[1]，茎、叶和种子皆可入药，具有清火退热、驱虫、解食物中毒作用[2]。本课题组前期研究表明，人面果叶的乙酸乙酯部位具有抗糖尿病和抗氧化作用[3-5]，其中人面果叶的乙酸乙酯部位以藤黄双黄酮（fukugetin）、倭氏藤黄双黄酮（volkensiflavone）、3，8双柚皮素、白果素、福木苷、GBla、GB2a等双黄酮类化合物为主[6，7]，在该有效部位有望开发出新型抗糖尿病药物。为下一步深度开发人面果叶，所以有必要建立一种有效、可靠的分析方法作为人面果叶质量控制的手段。指纹图谱可以较为全面客观地反映出中药及民族药复杂混合体系中各种化学成分浓度分布的整体状况[8，9]，能够有效的表征一个复杂的体系。本文收集了不同产地、不同季节的人面果叶，用高效液相色谱法建立了人面果叶指纹图谱，进行相似度分析，并基于指纹图谱信息进行化学模式识别研究，为人面果叶品种鉴别和质量评价提供较全面的评价方法。

2 仪器与材料

2.1 仪器

高效液相色谱仪（DIONEX U- 3000，美国赛默飞世尔有限公司）;十万分之一电子天平（AUW120D，岛津）;万分之一电子天平（CP224C，上海奥豪斯仪器有限公司）;电热恒温水浴锅（DK- 98-Ⅱ，天津市泰斯特仪器有限公司）;超声仪（KQ3200E，昆山市超声仪器有限公司）。

2.2 试药

色谱甲醇、乙腈（色谱纯，美国TEDIA公司）;甲醇、甲酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）;超纯水为实验室自制。福木苷（fukugiside）、GB2a、藤黄双黄酮（fukugetin）、GBla、volkensiflavone对照品（实验室自制，其结构1 H-NMR、13C-MNR、ESI- MS等確定，纯度大于98%，结构见图1）。

本研究中44批人面果叶分别购于昆明猎植中草药销售有限公司、广西民族医药研究院、云南西双版纳民族医药研究所。昆明猎植中草药销售有限公司采购的药材由中国科学院昆明植物研究所韩春艳博士鉴定，广西民族医药研究院采购的药材由广西民族医药研究院滕红丽主任药师鉴定，云南西双版纳民族医药研究所采购的药材由云南西双版纳民族医药研究所赵应红主任药师鉴定，经鉴定为藤黄科藤黄属植物人面果（Garcin-isxanthochymus）叶，来源见表1。

3 方法与结果

3.1 色谱条件

色谱柱：Agilent C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5μm）;检测波长：289 nm;流速：1.0mL/min;柱温：30℃;进样量：10 μL;流动相：乙腈（A） -甲醇（B）一0.5%磷酸水溶液（C）;梯度洗脱程序，见表2。

3.2 对照品溶液的制备

分别精密称取福木苷、GB2a，藤黄双黄酮，GBla，volkensiflavone对照品，加95%甲醇溶解，必要时超声处理，各自制成1 mg/mL的对照品溶液。

3.3 供试品的制备

取人面果叶粉末（过二号筛）约0.2 9，精密称定，置于100 mL圆底烧瓶中，精密加入95%甲醇25 mL，称重，水浴回流30 min，提取液冷却，用95%甲醇补足失重，过滤，取续滤液（进样前过0. 45 μm微孔滤膜），即得[10]。

3.4 方法学考察

3.4.1 精密度考察

取人面果叶粉末按照“3.3”法制备供试品溶液。按照“3.1”项下方法进行检测，连续进样6次。各个主要色谱峰保留时间RSD值为0.421%，峰面积RSD值0.284%，结果表明仪器精密度良好。

3.4.2 重复性考察

取6份同一批次人面果叶粉末按照“3.3”法制备成供试品溶液。按照“3.1”项下方法进行检测，各个主要色谱峰保留时间RSD值为1.328%，峰面积RSD值为1. 875%，结果表明此检测条件重复性良好。

3.4.3 稳定性考察

取人面果叶粉末按照“3.3”法制备成供试品溶液。在Oh，4h，8h，12 h，16 h，20 h，24 h后，按照“3.1”项下方法进行检测。各个主要色谱峰保留时间RSD值为1.036%，峰面积RSD值为1.853%，结果表明样品稳定性较好。

3.5 人面果叶HPLC指纹图谱的建立与共有峰的鉴定

取表1中44批人面果叶药材，分别按“3.3”法制备供试品溶液，按“3.1”项下色谱条件测定。将得到的指纹图谱的AIA数据文件导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A版）”软件中，得到44批人面果叶样品的HPI_C指纹图谱和对照品HPLC图谱，见图2～3。确定了11个共有峰，见图3，共有峰的保留时间见表3。结合表3和图3，可推断6号共有峰为福木苷，8号共有峰为GB2a，9号共有峰为藤黄双黄酮，10号共有峰为GBla。选择9号峰（藤黄双黄酮）作为参照峰计算各共有峰相对峰面积，共有峰的相对峰面积的RSD值在25. 44%～72. 83%之间，峰面积差异较大，结果见表4。

3.6 相似度评价

采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（ 2004A版）”，将44批样品检测指纹图谱与对照指纹图谱进行匹配，并进行相似度评价，各批样品相似度在0. 65以上，结果见表5。将各季度样品分别进行相似度比较，结果表明每个季度内，各批次样品相似度较高，这说明产地对样品造成的影响较小，所以造成样品整体相似度较低的原因是同一样品在不同季度相似度较低造成的，结果见表6。

3.7 主成分分析

使用SPSS19.O统计软件对44批样品共有峰的相对峰面积（表4）进行主成分分析，结果见表7，碎石图见图4。由表7可知，前3个主成分因子的特征值>1，分别为5. 228、1.653、1.302，是影响人面果叶质量评价的主要因子;3个主成分因子的累积方差贡献率达到81. 821%，表明前3个主成分因子即可以代表44批药材81%以上的变化情况。结合碎石图可见曲线在成分3处存在明显拐点，说明前3个主成分的分析结果基本显示了不同批次人面果叶药材质量。针对前3个主成分进行分析，得到主成分得分、综合得分和排序结果见表8。结果表明人面果叶综合得分较高的前5位分别为编号S23、SI、S34、S12、S5批次的人面果叶，其中前四位为广西那坡的样品。综合得分较低的后5位分别为编号S14、S37、S32、S36、S10批次的人面果叶。

3.8 聚类分析

采用离差平方和（ ward）法选取欧式距离平方和作为样本的测度，对不同批次人面果叶进行系统聚类分析，结果见图5。从图中可以看出聚类趋势可分为A、B两大类，A大类下可分为3小类。其中B类主要以第三季度样品为主，A大类下的3小类分别以第一季度、第二季度、第四季度为主。总体看来，分类趋势与季节的关联度比较大。这与相似度分析中的结果较为重合。

4 讨论

本研究建立了人面果叶HPLC指纹图谱，综合运用相似度评价、主成分分析和聚类分析对44批不同产地、季节的人面果叶样品进行了研究。根据保留时间，将已知的双黄酮化合物与指纹图谱中的共有峰进行对照，初步推断在11个共有峰中有4个是已知的双黄酮类化合物福木苷、GB2a、藤黄双黄酮和GBla，此结果可以说明双黄酮化合物为人面果叶的特征化合物。同时相似度评价与聚类分析的分析结果较为重合，结果显示季节对人面果叶的影响大于产地的影响。主成分分析是从化学成分上揭示了不同产地和不同季节人面果叶之间的差异，并客观地反映了人面果叶内在质量。该方法具有特征性强、稳定可靠、重复性好的特点，可以用于人面果叶的质量评价，为下一步制定人面果叶的质量标准提供科学依據。

参考文献：

[1]国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草[M].上海：上海科学技术出版社，1999：589-594.

[2]林艳芳，依专，赵应红.中国傣医药彩色图谱[M].昆明：云南民族出版社，2003：6.

[3]付蒙，胡鑫，徐婧，等，人面果叶、根部、果实提取物体外抗糖尿病活性成分研究[J].天然产物研究与开发，2014，26 （2）：255 -259.

[4]刘流，李芸芳，甘飞，等，人面果叶子的化学成分研究[J].中国中药杂志，2016，41（11）：2098-2104.

[5]付蒙，冯慧瑾，陈玉，等.人面果叶子、根部、果实提取物体外抗氧化活性研究（英文）[J].中国天然药物.2012，10（2）：129-134.

[6]Li Y F，Chen Y， Xiao C Y， et al. Rapid scrcening and identififica-tion of a amylase inhibitors from （;arcinia xanthochymus usingenzyme- immobilized magnetic nanoparticles coupled with HPLCand MS [J]. Journal of Chromatography B. 2014（ 960）： 166-173.

[7]Li Y F， Xu J，Chen Y，et al. Screening of inhibitors of glycogensynthase kinase-3p From traditional Chinese Medicines using en-zyme- immobilized magnetic beads combined with highperfor-mance liquid chromatography [J]. Journal of Chromatography A，2015（1425）：8-16.

[8]谢培山，中药色谱指纹图谱[M].2版，北京：人民卫生出版社，2005：22-75.

[9]岳显可，杜伟锋，凌珏，等.基于高效液相色谱指纹图谱及聚类分析、主成分分析的市售片姜黄质量研究[J].时珍国医国药，2017，28（5）：1095 -1098.

[10]刘慧，赵应红，杨博，等.傣药人面果叶质量标准研究[J].中华中医药杂志，2019，34（6）：2762-2766.

作者简介：吕贵萍（1994-），女，中南民族大学药学院硕士研究生。

通讯作者：杨光忠（1968-），男，博士，教授，主要从事天然产物化学的研究工作。