远志皂苷改善APP/PS1转基因小鼠认知功能损伤的机制研究

王哲，崔小川，周高峰，孙红旭，唐玲*

1重庆医科大学附属大学城医院神经内科，重庆 401331；2南京医科大学附属无锡市人民医院，江苏无锡 214023； 3江南大学无锡医学院，江苏无锡 214122

阿尔兹海默病(Alzheimer's disease，AD)是发生在老年期或者老年前期的神经退行性疾病，是最常见的痴呆类型。AD的主要行为学特征是进行性的认知能力消退及人格改变[1]。AD的组织病理学特征是β-淀粉样多肽(β-amyloid，Aβ)沉积形成的神经细胞外大量老年斑以及微管相关蛋白tau过度磷酸化形成的神经元纤维缠结(neurofibrillary tangles，NFTs)[2]。随着我国人口老龄化的加重，寻求治疗AD的有效策略显得尤为迫切。近年来，中草药对AD的治疗研究取得了一定进展[3]。远志皂苷是从中药远志中提取出的有效单体成分，可通过血脑屏障发挥益智护脑的作用[1,4-5]。然而，远志皂苷对认知障碍是否具有缓解作用目前尚不清楚。本研究对6月龄APP/PS1小鼠连续8周腹腔注射远志皂苷，观察其对APP/PS1小鼠认知及病理学的影响并探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组 18只雄性APP/PS1双转基因小鼠(6月龄，20～25 g)购自南京模式动物中心，采用抛硬币法随机分为远志皂苷治疗组[8 mg/(kg·d)]与生理盐水对照组，每组9例；选取9只同月龄野生型小鼠作为野生型对照组。以上小鼠均饲养于SPF环境。远志皂苷治疗组APP/PS1小鼠连续8周每天腹腔注射8 mg/kg远志皂苷，生理盐水对照组APP/PS1小鼠连续8周每天腹腔注射等体积生理盐水，野生型对照组野生型小鼠连续8周每天腹腔注射等体积生理盐水。实验过程符合国家和单位有关实验动物管理和使用的规定。

1.2试剂与药品 远志皂苷(纯度≥95%)购自中国食品药品检定研究院，硫黄素S购自Sigma公司，α-微管蛋白(DM1A)抗体购自Abcam公司，β-淀粉样多肽(Aβ42)ELISA试剂盒购自R&D公司，突触后致密蛋白-95(PSD-95)及tau蛋白的231、214、396磷酸化位点(p-tau Ser231、Ser214、Ser396)抗体购自Millipore公司，二抗购自武汉博士德生物工程有限公司，BCA试剂盒、蛋白酶抑制剂、Loading Buffer购自碧云天生物技术有限公司，蔗糖、无水乙醇及多聚甲醛购自国药集团化学试剂有限公司。

1.3Morris水迷宫实验检测小鼠行为认知能力 连续给药8周后，进行Morris水迷宫实验(实验时剔除不擅长游泳小鼠)。水迷宫为一直径100 cm、高50 cm的圆形水池，被分为四个象限，选定第一象限放入一圆形平台(直径8 cm，高29 cm)。实验时将迷宫内注入温水[(22±1) ℃]，并加入奶粉使池内水浑浊不能见底，且使水面高出平台1 cm。于Morris水迷宫前5 d行定位航行实验：小鼠分别在第一、二、三、四象限放入水中进行寻找平台训练，若在60 s内找到平台则记录其找到平台所需时间，若超过60 s未找到平台则使用木棒引导至平台停留10 s。每次从迷宫中拿出小鼠都应使用干毛巾擦拭，用电热吹风吹干皮毛。小鼠的游泳轨迹和找到平台的时间可被顶端的红外摄像头记录，以便后期对数据进行分析处理。第6天为空间探索实验：将水平台撤除，所有实验小鼠均面朝池壁在第三象限放入水中，记录在1 min之内找到平台位置所用时间和穿越平台所在位置的次数。

1.4免疫荧光检测海马区PSD-95、p-tau Ser231的表达 水迷宫实验结束后，取远志皂苷治疗组、生理盐水对照组及野生型对照组中各3只小鼠进行灌注后取脑，使用多聚甲醛固定3 d后使用20%、30%蔗糖溶液进行梯度脱水，之后对小鼠脑组织进行冰冻切片，脑切片置于防冻液中，储存于-20 ℃冰箱备用。取每只小鼠不同层面的3张脑切片，经PBS溶液漂洗3次，每次10 min，破膜后使用3%BSA常温封闭1 h，使用一抗孵育过夜；PBS漂洗3次，加入相应二抗，37 ℃孵育1 h，漂洗5次，每次10 min，贴片后用蔡司荧光显微镜拍摄海马区PSD-95及p-tau Ser231的表达情况。

1.5硫黄素染色检测小鼠脑内老年斑数量 取每只小鼠不同层面的3张冰冻脑切片，PBS漂洗10 min×3次，在0.0125%硫磺素、50%乙醇溶液中染色8 min，50%乙醇溶液洗涤5 min×3次，PBS漂洗8 min。采用蔡司荧光显微镜拍摄脑内老年斑，使用Image J软件分析老年斑数量。

1.6ELISA检测海马区Aβ42含量 水迷宫实验结束后，取远志皂苷治疗组及生理盐水对照组各6只小鼠，将其大脑海马分离后置于含蛋白酶抑制剂RIPA缓冲液的匀浆器中进行匀浆，之后进行短暂的超声波处理，匀浆液在4 ℃下12 000 r/min离心30 min，收集上清。按照ELISA试剂盒操作说明书定量检测Aβ42含量。

1.7Western blotting检测PSD-95及p-tau Ser231、Ser214、Ser396表达水平 取小鼠海马组织加入蛋白裂解液，在冰盒裂解30 min，提取蛋白，使用BCA试剂盒测定其蛋白浓度。加入上样缓冲液后于100 ℃煮5～8 min，制备成样品-20 ℃保存备用。样品经100 ℃金属浴后冷却上样，然后进行SDS-PAGE凝胶电泳分离，采用湿转法转至PVDF膜上，室温下封闭2 h后加入一抗，4 ℃孵育过夜后TBST洗膜30 min，用二抗孵育后化学发光显影，使用Image J软件分析PSD-95及p-tau Ser231、Ser214、Ser396的表达水平。

1.8统计学处理 采用SPSS 18.0软件进行统计分析。所有数据以±s表示，在满足方差齐性的条件下，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用Bonferroni-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1远志皂苷对APP/PS1小鼠学习记忆能力的影响 定位航行实验发现，生理盐水对照组小鼠的逃避潜伏期自第2天起较野生型对照组明显延长(P<0.05)，远志皂苷治疗组小鼠的逃避潜伏期自第3天起较生理盐水对照组明显缩短(P<0.05)；与野生型对照组相比，远志皂苷治疗组小鼠的逃避潜伏期在前4 d无明显改变，差异无统计学意义(P>0.05)，在第5天时逃避潜伏期明显延长[(27.4±3.9) s vs. (18.5±4.7) s]，差异有统计学意义(P<0.05，图1)。空间搜索实验发现，生理盐水对照组较野生型对照组小鼠定位目标位置花费时间延长[(40.4±3.4) s vs. (14.1±7.3) s]，差异有统计学意义(P<0.05)；远志皂苷治疗组小鼠定位目标位置时间与生理盐水对照组比较明显缩短[(21.0±8.9) s vs. (40.4±3.4) s]，差异有统计学意义(P<0.05)，但与野生型对照组相比无明显改变，差异无统计学意义(P>0.05)。生理盐水对照组小鼠穿越平台次数较野生型对照组明显减少(0.428±0.035 vs. 2.285±1.380)，差异有统计学意义(P<0.05)；远志皂苷治疗组小鼠穿越平台次数多于生理盐水对照组(1.714±0.756 vs. 0.428±0.035，P<0.05)，但与野生型对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2远志皂苷对APP/PS1小鼠海马区PSD-95表达的影响 免疫荧光检测结果显示，生理盐水对照组小鼠海马区PSD-95表达较野生型对照组减少；而与生理盐水对照组相比，远志皂苷治疗组小鼠海马区PSD-95表达增加(图2)。Western blotting检测结果显示，生理盐水对照组小鼠海马PSD-95相对含量低于野生型对照组(0.570±0.700 vs. 0.740±0.054)，差异有统计学意义(P<0.05)；远志皂苷治疗组小鼠海马PSD-95相对含量明显高于生理盐水对照组(0.800±0.098 vs. 0.570±0.700，P<0.05)，但与野生型对照组比较差异无统计学意义(P>0.05，图3)。

图1 远志皂苷对APP/PS1小鼠学习记忆能力的影响(n=8)Fig.1 Effect of tenuigenin on the cognitive function of APP/PS1 mice (n=8)

图2 各组小鼠海马区PSD-95表达的免疫荧光染色图(×20)Fig.2 The expression of PSD-95 in brain hippocampus of APP/PS1 mice (×20)

图3 各组小鼠海马区的PSD-9 5蛋白表达(Wester n blotting)Fig.3 Expression of PSD-9 protein in the hippocampus of each group of mice (Western blotting)

2.3远志皂苷对APP/PS1小鼠海马区Aβ沉积的影响 野生型对照组小鼠海马区无老年斑沉积。与生理盐水对照组相比，远志皂苷治疗组小鼠海马区内老年斑数量明显减少[(8.889±1.692)个 vs. (18.000±2.000)个]，差异有统计学意义(P<0.05，图4)。ELISA检测结果显示，与生理盐水对照组相比，远志皂苷治疗组小鼠海马区内Aβ42含量明显减少[(2.859±0.864) ng/mg vs. (5.154±0.735) ng/mg]， 差异有统计学意义(P<0.05)。

2.4远志皂苷对APP/PS1小鼠海马区tau蛋白磷酸化水平的影响 免疫荧光结果显示，生理盐水对照组小鼠海马区p-tau Ser231表达较野生型对照组增加；与生理盐水对照组相比，远志皂苷治疗组小鼠海马区p-tau Ser231表达减少(图5)。Western blotting检测结果显示，生理盐水对照组小鼠海马区p-tau Ser231、Ser214、Ser396蛋白表达水平高于野生型对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)；远志皂苷治疗组小鼠海马区p-tau Ser231、Ser214、Ser396蛋白表达水平低于生理盐水对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)；远志皂苷治疗组小鼠海马p-tau Ser231、Ser214、Ser396蛋白表达水平高于野生型对照组，除p-tau Ser231外差异均有统计学意义(P<0.05，图6、表1)。

图4 各组小鼠海马区Aβ沉积情况(硫黄素染色 ×4)Fig.4 Deposition of Aβ plaques in the hippocampus of each group of mice (Thioflavin staining ×4)

图5 各组小鼠海马区p-tau Ser231表达情况(免疫荧光染色 ×20)Fig.5 Expression of p-tau Ser231 in hippocampus of APP/PS1 mice (Immunofluorescence staining ×20)

图6 各组小鼠海马区p-tau Ser231、Ser214、Ser396的表达(Western blotting)Fig.6 Expressions of p-tau Ser231, Ser214 and Ser396 protein in the hippocampus of each group mice (Western blotting)

表1 各组小鼠海马区p-tau Ser231、p-tau Ser214、p-tau Ser396表达水平比较(±s，n=6)Tab.1 Comparison of expression levels of p-tau Ser231, Ser214, Ser396 among each group of mice (±s, n=6)

表1 各组小鼠海马区p-tau Ser231、p-tau Ser214、p-tau Ser396表达水平比较(±s，n=6)Tab.1 Comparison of expression levels of p-tau Ser231, Ser214, Ser396 among each group of mice (±s, n=6)

与野生型对照组比较，(1)P<0.05；与生理盐水对照组比较，(2)P<0.05。

组别 p-tau Ser231 p-tau Ser214 p-tau Ser396野生型对照组 0.540±0.076 0.305±0.088 0.338±0.052生理盐水对照组0.947±0.131(1) 0.832±0.161(1) 0.819±0.053(1)远志皂苷治疗组0.568±0.051(2) 0.472±0.094(1)(2) 0.452±0.071(1)(2)F 36.050 30.393 105.887 P<0.001 <0.001 <0.001

3 讨 论

AD是以认知能力受损为主要临床表现的神经退行性疾病，目前较为认可的AD发病机制假说包括Aβ沉积学说和tau蛋白过度磷酸化假说。抑制Aβ沉积及减少tau蛋白的异常磷酸化对治疗AD具有重要意义[2]。学习记忆能力是大脑的一项重要功能，大脑中的海马体是主要负责学习记忆的结构，学习记忆水平的改善是评价AD治疗效果的重要指标[4]。目前用于AD研究的动物模型较多，其中APP/PS1小鼠模型是国际公认的动物模型之一，可较好模拟AD的行为及病理特征[5]，小鼠在4～6月龄可出现行为学的异常症状及Aβ沉积[6]。随着现代药理学研究的发展，远志皂苷越来越多的药理学作用被人们所发现。Cao等[7]发现，远志皂苷可激活γ-氨基丁酸能神经元，促进小鼠慢波睡眠；Yuan等[8]发现，远志皂苷可抑制帕金森模型小鼠中小胶质细胞NLRP3炎性小体的激活以保护多巴胺能神经元；Huang等[9]的研究表明，远志皂苷可通过提高海马神经元的突触可塑性增强小鼠学习能力。远志皂苷治疗AD的研究主要集中在Aβ造模AD鼠上，而在APP/PS1双转基因小鼠中的研究仍较少。兴桂华等[10]发现，远志皂苷可以通过影响Bcl-2水平提升小鼠的学习记忆能力；陈庆林等[11]的研究表明，远志皂苷可通过保护胆碱能系统改善Aβ40造成的学习记忆损伤。本研究的Morris水迷宫实验结果显示，连续8周给予远志皂苷后APP/PS1小鼠学习记忆能力明显增强，同时突触后蛋白PSD-95表达量相较于生理盐水对照组明显增加。PSD-95的表达量与聚集在突触后膜上的神经连接蛋白量相关，其表达量的增加可使兴奋性突触数量有所增多[12]。有研究表明，当小鼠丧失PSD-95后，其空间记忆能力会下降，同时突触信号传递减弱[13]。本研究结果显示，远志皂苷可恢复APP/PS1小鼠脑内PSD-95的表达水平及小鼠的认知能力，PSD-95的上调有利于认知损伤的修复。

APP/PS1小鼠可较早地出现Aβ沉积，Aβ在脑内的异常沉积可诱发神经炎症、神经元丢失、突触损伤等，最终导致患者的认知能力下降[14]。大量研究表明，向动物海马区立体定位注射Aβ后可导致组织坏死及认知损伤等一系列毒性反应[15-16]。 因此，抑制Aβ的沉积是较为公认的治疗AD的有效手段之一。本研究发现，远志皂苷可使APP/PS1小鼠海马区的Aβ沉积明显减少。有研究通过对5XFAD模型鼠脑内的PSD-95及Aβ进行双标记发现，随着Aβ沉积增多，PSD-95呈减少的趋势[17]。本研究结果显示，远志皂苷可能通过抑制海马区Aβ沉积、上调PSD-95的表达而改善学习记忆水平。APP/PS1模型小鼠可过表达淀粉样前体蛋白(amyloid precursorportein，APP)，而APP通过γ分泌酶代谢后产生Aβ[18]。有研究表明，当药物的抑制作用使γ分泌酶表达降低时，Aβ沉积将会减少。因此，远志皂苷减缓Aβ沉积的机制可能与其抑制了APP的γ分泌酶代谢途径有关。

Tau蛋白在生理情况下主要位于神经元轴突内，它与微管相结合可维持微管的稳定性。Tau蛋白与神经信号的正常传递及轴突生长发育等密切相关[19]。Tau蛋白的异常磷酸化将使其丧失正常的生理功能，聚集形成神经纤维缠结，导致神经细胞骨架破坏，最终导致神经细胞的丢失[18]。已有研究发现，tau蛋白的过度磷酸化可导致神经元死亡及记忆损伤[20-21]。Tau蛋白Ser231、Ser214、Ser396位点是较为重要的磷酸化位点，其磷酸化水平与微管稳定性密切相关[22-23]。徐柯乐等[24]研究表明，远志皂苷可缓解Aβ40引起的tau蛋白Ser396位点过度磷酸化。本研究也发现，远志皂苷可缓解tau蛋白Ser231、Ser214、Ser396位点的磷酸化水平，有助于防治过度磷酸化的tau蛋白引起的神经退行性病变，对AD的治疗具有潜在意义。对JNPL3小鼠模型的研究表明，神经纤维缠结会导致PSD-95水平下降[17]， 而本研究中的远志皂苷可缓解tau蛋白Ser231、Ser214、Ser396位点磷酸化，从而有利于PSD-95水平的恢复。蛋白激酶及磷酸酯酶之间的平衡是调控tau蛋白磷酸化的主导因素，蛋白激酶GSK-3β表达降低可减弱tau蛋白的磷酸化水平[25]。陈玉静等[26]发现，远志皂苷可使MAPT激酶GSK-3β表达水平降低。因此，笔者将在后续的实验中进一步探讨远志皂苷是否通过抑制GSK-3β活性及相关信号通路而减弱tau蛋白的异常磷酸化。

远志皂苷是益智中药远志的主要药用成分，目前关于其对神经退行性疾病的治疗作用已有一些报道[8,27]。本研究中，远志皂苷可增强APP/PS1小鼠的学习记忆能力，提高小鼠海马区PSD-95的表达水平，结合硫黄素染色及ELISA检测发现，远志皂苷可缓解Aβ沉积及老年斑形成，同时还发现其可减轻多个位点tau蛋白的磷酸化水平。笔者推测小鼠认知水平的提升可能是通过远志皂苷减轻Aβ沉积及tau蛋白磷酸化水平实现的。下一步将进一步探索远志皂苷对Aβ代谢及tau蛋白磷酸化的具体作用机制及可能的信号通路。