丙泊酚中/长链脂肪乳注射液中溶血磷脂酰胆碱和溶血磷脂酰乙醇胺的测定方法验证

丁丽燕 郑娟 朱晓晓

摘 要 目的：开展HPLC-ELSD法测定丙泊酚中/长链脂肪乳注射液中溶血磷脂酰胆碱（LPC）和溶血磷脂酰乙醇胺（LPE）的方法学验证。 方法：参照国家药典委员会颁布的丙泊酚乳状注射液征求意见稿项下LPC和LPE的分析方法进行验证。结果：LPC在20.56 ～411.12 mg/ml（R=0.999 8），LPE在5.79～115.71 mg/ml（R=0.999 4）范围内线性良好；他们的定量限浓度分别为23.1 mg/ml、10.3 mg/ml，检测限浓度分别为9.2 mg/ml、4.1 mg/ml。两者加样回收率RSD分别为0.7%、8%；方法重复性、耐用性好。结论：本检测方法专属性强，结果可靠，重复性好，可用于丙泊酚中/长链脂肪乳注射液的质量评价。

关键词 丙泊酚中/长链脂肪乳注射液 溶血磷脂酰胆碱 溶血磷脂酰乙醇胺

中图分类号：R927.11； R971.2 文献标志码：A 文章编号：1006-1533（2020）11-0098-05

Validation of the method for the determination of lysophophatidyl choline and lysophosphatidyl ethanolamine in propofol medium and long chain fat emulsion injection

DING Liyan*， ZHENG Juan， ZHU Xiaoxiao（Shanghai Joy Biopharm CO.， LTD.， Shanghai Engineering Research Center of Lipid Emulsion， Shanghai 201203， China）

ABSTRACT Objective： To verify the HPLC-ELSD method for the determination of lysophosphatidyl choline （LPC） and lysophosphatidyl ethanolamine （LPE） in propofol medium and long chain fat emulsion injection. Methods： The method was verified based on a manuscript of request for comments on propofol emulsion injection by Chinese Pharmacopoeia Commission. Results： The standard curves were linear over the range of 20.56-411.12 mg/ml （R=0.999 8） for LPC and 5.79-115.71 mg/ml（R=0.999 4） for LPE. Their quantification limits， detection limits and relative standard deviations （RSD） were 23.1 mg/ml， 9.2 mg/ml and 0.7% for LPC and 10.3 mg/ml， 4.1 mg/ml and 8% for LPE， respectively. The durability and repeatability of the method were good. Conclusion： The method is accuracy， effective and can be used for the quality control of propofol medium and long chain fat emulsion injection.

KEy WORDS propofol medium and long chain fat emulsion injection； lysophosphatidyl choline； lysophosphatidyl

ethanolamine

丙泊酚注射液，作為一种静脉麻醉药，以其起效迅速、作用时间短、清醒快、易于控制和不良反应少等特点，被麻醉医师广泛用于全麻诱导，硬膜外麻醉辅助镇静，无痛人流，无痛胃镜等领域。其术后恶心、呕吐率低等优点，进一步奠定其门诊手术首选全麻药物的地位[1-2]。

卵磷脂具有乳化、分散、助渗等特性，常作为乳化剂、分散剂、稳定剂等广泛应用于包括注射在内的液体制剂、半固体制剂、固体制剂的制造。卵磷脂在制剂的制备和储存过程中因受到pH、氧化等原因造成水解而产生溶血磷脂酰胆碱（LPC）和溶血磷脂酰乙醇胺（LPE），造成体系被破坏而降低制剂稳定性；另LPC和LPE具有一定的溶血作用，改变细胞渗透性等，关系到产品的安全性[3-5]。因此，该指标对于丙泊酚乳状注射剂的稳定性和安全性具有科学的意义。丙泊酚中/长链脂肪乳注射液游离药物浓度和注射疼痛发生率较丙泊酚长链脂肪乳显著降低，且在长期输注过程中不易引起高脂症的发生，还可减轻肝脏负担，更适用于肺功能不全的患者和婴幼儿麻醉，是目前市场上最安全有效的丙泊酚制剂[6]。目前国内多家企业进行丙泊酚中/长链脂肪乳注射液的仿制研究，为确保产品安全性，国家药典委颁布的丙泊酚乳状注射液征求意见稿从第一版上升至第四版[7]，不断提升产品标准。2015年版《中国药典》四部收录“蛋黄卵磷脂（供注射用）”有关物质项LPC和LPE的检测[8]。丙泊酚乳状注射液征求意见稿也将LPC和LPE作为影响其质量的特定杂质来控制。研究初期按丙泊酚中/长链脂肪乳注射液原研制剂贝朗产品进口注册标准（JX20100226）的检测方法检测LPC，发现存在重现性差、溶液难溶解和耐用性差等问题，且研究初期多数文献仅对LPC的测定进行探讨[9-10]。本实验参考征求意见稿（第四版）丙泊酚乳状注射液项下LPC和LPE的检查方法，对丙泊酚中/长链脂肪乳注射液中卵磷脂的分解产物LPC和LPE进行了方法学验证。

1 材料和方法

1.1 儀器

E2695高效液相色谱仪（美国Waters公司，带2424ELS蒸发光散射检测器）；CPA225D精密天平（德国Sartorious公司）。

1.2 试药

丙泊酚中/长链脂肪乳注射液（上海乔源生物制药有限公司，20 ml：200 mg，批号：BZA171001B、BZA171002B和BZA171003B）；LPC、LPE（99.4%、99.2%，中国食品药品检定研究院）；异丙醇、甲醇、正己烷和正庚烷（色谱纯，Merck公司）。

1.3 方法

参考文献[7]，雾化气压力为45 psi，配制溶液所用的溶解液为三氯甲烷-甲醇（2∶1），稀释液为异丙醇-正庚烷（2∶1）。

1.3.1 溶液制备

1）按文献[7]配制系统适应性溶液。

2）LPE定位溶液 取LPE对照品4.55 mg置10 ml量瓶，加溶解液适量使溶解，用稀释液定量稀释至刻度，摇匀即得。

3）LPC定位溶液 取LPC对照品4.92 mg，置10 ml量瓶，加溶解液适量使溶解，用稀释液定量稀释至刻度，摇匀即得。

1.3.2 标准曲线

精密称取LPC和LPE对照品适量，加溶解液适量使溶解，用稀释液定量稀释制成每1 ml中分别含LPC 0.02、0.04、0.1、0.16、0.2、0.25、0.4 mg和LPE 0.005、0.01、0.025、0.04、0.05、0.06、0.1 mg的溶液，作为对照品溶液。以峰面积对数（y）为纵坐标，以浓度对数（x）为横坐标进行线性回归。

1.3.3 检测限和定量限

当信噪比分别为3：1和10：1得到检测限和定量限。

1.3.4 专属性

分别精密称取LPC对照品和LPE对照品适量，分别置2个量瓶中，用溶解液适量使溶解，用稀释液稀释成LPC和LPE的浓度分别约为0.2 mg/ml和0.1 mg/ml的溶液。取供试品1 ml，置10 ml量瓶中，加LPC对照品溶液4 ml和LPE对照品溶液2 ml，用稀释液稀释至刻度，摇匀。

1.3.5 准确度

准确度贮备液：精密称取LPC对照品和LPE对照品适量，用溶解液适量使溶解，用稀释液分别制备成每1 ml含LPC 0.4 mg和LPE 0.12 mg。空白溶液：取供试品0.5 ml，置5 ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀。准确度溶液：取3个5 ml量瓶，分别加入供试品0.5 ml，再分别加入准确度贮备液2.0、2.5或3.0 ml，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，制成限度80%、100%、120%三种浓度的溶液。每个浓度平行配制3份。

1.3.6 精密度

系统精密度：取“专属性”项下的对照品溶液，连续进样6次，考察6次峰面积的RSD。重复性：精密称取LPC对照品和LPE对照品适量，用溶解液适量使溶解，用稀释液定量稀释制成每1 ml分别含LPC 0.02、0.04、0.1、0.2 mg和LPE 0.01、0.02、0.05、0.1 mg的溶液。取1 ml供试品溶液，置10 ml量瓶中，用稀释液稀释至刻度，摇匀。平行配制6份。

1.3.7 耐用性

取1 ml供试品溶液，置10 ml量瓶中，用稀释液稀释至刻度，摇匀。在不同流速（0.9、1.0、1.1 ml/min）、柱温（38、40、42 ℃）、流动相比例（3%、5%、7%）条件下进样。

1.3.8 溶液稳定性

对照品溶液：精密称取LPC对照品和LPE对照品适量，用溶解液适量使溶解，用稀释液定量稀释制成每1 ml分别含LPC 0.2 mg和LPE 0.1 mg的溶液。供试品溶液：取1 ml供试品溶液，置10 ml量瓶中，用稀释液稀释至刻度，摇匀。对照品溶液分别在室温和冷藏（2～8℃）条件下放置，供试品溶液在室温条件下放置，于0、2 d取样测定。

1.3.9 样品中LPC和LPE的测定

分别取3批供试品1.0 ml置10 ml量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀，测定LPC和LPE。

2 结果

2.1 系统适应性及杂质定位

系统适用性溶液中溶血磷脂酰乙醇胺峰与相邻峰间的分离度大于1.5，三次连续进样的峰面积RSD不大于2%，系统适用性良好（表1、2）。

2.2 标准曲线

LPC在浓度20.56 ～411.12 mg/ml范围内，线性关系良好，线性方程为y=1.670 6x+2.352 5，R=0.999 8；LPE在浓度5.79～115.71 mg/ml范围内，线性关系良好，线性方程为y=1.657x+2.563 1，R=0.999 4。

2.3 检测限和定量限

LPC和LPE的定量限浓度分别为23.1 mg/ml、10.3 mg/ml；LPC和LPE的检测限浓度分别为9.2 mg/ml、4.1 mg/ml。

2.4 专属性

加标供试品溶液色谱图显示LPC和LPE峰与其它峰的分离度均大于1.5，该方法专属性好（图1）。

2.5 准确度

经计算，LPC和LPE的准确度分别为93.4%～ 95.9%、92.4%～107.3%，均在90%～110%以内，RSD均不大于10%，符合中国药典有关规定[8]374-377（表3）。

2.6 精密度

2.6.1 系統精密度

LPC和LPE的峰面积RSD均不大于2%（表4）。

2.6.2 重复性

取0.04、0.1、0.2 mg/ml三个浓度的数据作线性，LPC线性方程为Y=1.670 4X+2.261 5，R=1；LPE线性方程为Y= 1.697X + 2.327 7，R=1。LPC含量的RSD为1.0%，不大于5%，LPE均未检测出，符合要求（表5）。

2.7 耐用性

在不同流速、柱温、流动相比例条件下进样，系统适用性溶液的分离度均不小于1.5，各条件下供试品溶液的LPC含量RSD均不大于5%，LPE均未检出。表明此方法耐用性良好（表6）。

2.8 溶液稳定性

LPC和LPE浓度变化均不大于5%（表7）。表明对照品溶液在室温和冷藏（2～8 ℃）条件下放置2 d，供试品溶液在室温条件下放置2 d，不影响结果测定。

2.9 样品中LPC和LPE的测定

3批样品的LPC和LPE均符合质量标准（表8）。

3 讨论

本研究按照原研制剂丙泊酚中/长链脂肪乳注射液进行仿制，初期依据进口注册标准（JX20100226）仅对LPC进行方法学的研究，发现重现性、耐用性、准确度等较差，可能与仪器、色谱柱、溶剂、不同来源药用辅料等因素相关，我们只对我公司特定生产工艺的产品及色谱条件进行了方法学研究。卵磷脂是脂肪乳剂中引入LPC和LPE的主要途径，丙泊酚脂肪乳注射液（征求意见稿）控制了LPC和LPE限度，故本产品仿制时结合了原研制剂（LPC≤2.0 mg/ml）和丙泊酚脂肪乳注射液（征求意见稿）（LPC≤2.0 mg/ml、LPE≤0.6 mg/ml）的要求，同时考虑本产品采用的卵磷脂为蛋黄卵磷脂（Lipoid GmbH），其在药用辅料中的不同来源对含量的限值有影响[11]，制定了本产品质量标准（LPC≤1.5 mg/ml、LPE≤0.5 mg/ml），并进行了仿制药注册申报。开发仿制药不能局限于一个标准，尤其是特定杂质、有关物质等限量检测项，可参考多个标准，来制定更严、更合理、更准确的标准，保障产品的安全和有效。

本研究参照丙泊酚乳状注射液征求意见稿（第四版）中LPC和LPE的分析方法进行了验证，在此基础上，对诸如雾化气压力等仪器参数进行适当调整后，可有效检出丙泊酚中/长链脂肪乳注射液中卵磷脂的降解产物LPC和LPE。LPC和LPE主要来源为辅料卵磷脂及高温灭菌阶段，产品未检测出LPC，可能与本研究采用的精制蛋黄卵磷脂和经验证的高温灭菌工艺较为完备有关。本研究对照品溶液中LPC为分叉峰，与文献报道一致[12]，因此在产品检测时需将与对照品对应的分叉峰一起计入杂质。通过研究，该方法专属性、重复性及耐用性好，适合丙泊酚中/长链脂肪乳注射液的LPC和LPE控制，也可为各仿制该产品的企业提供数据支持。

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