黄芪丹参配伍提取物在缺血性心肌中抑制心肌重塑的作用

李梦华， 张瓅方

(1.南阳医学高等专科学校，南阳 473061；2.南阳理工学院河南省张仲景方药与免疫调节重点实验室，南阳 473004)

由国家心血管中心发布的《中国心血管病报告2018》中明确指出，中国成年人群中75%存有心血管问题，心血管患病人数接近3亿人次，占据国内居民因疾病死亡的40%以上，死亡率居首位。中国已经成为全球心脏病死亡人数最多的国家[1-2]。心肌梗死(mycardial infarction,MI)是影响人类健康的重要疾病之一，中国自2002年开始MI死亡率就一直呈现快速上升态势。虽然较早采取药物溶栓、行冠状动脉旁路移植术、经皮冠状动脉介入治疗等措施，MI死亡率有所下降，但部分患者在服药或术后依然出现心室重塑(ventricular remodeling，VR)和心力衰竭(heart failure，HF)等并发症[3]。MI早期发生的VR表现为梗死区心肌细胞出现炎症坏死、结构纤维化，随着病情发展，波及到非梗死区心肌细胞代偿性肥大、细胞凋亡、细胞外基质结构重建，加重心力衰竭甚至心脏破裂[4-5]。研究证实心肌炎症、纤维化、凋亡及内皮细胞功能障碍是MI后心肌重塑的典型病理特征[6]，如何有效逆转MI心室重塑，延缓MI导致的慢性心力衰竭，是近年来研究缺血性心脏病的热点之一。早在东汉时期医圣张仲景在《伤寒杂病论》中记载“干血不去，灌溉不周”，中医认为血脉循行依赖于气的推动，因此有着“气为血之帅，血为气之母”的理论阐释。遍览历代中医在治疗血瘀、血虚等疾病时，多将补气与活血药物联合使用。有研究统计，在治疗心绞痛、心肌梗死、心律失常等血管病时，黄芪、丹参占据药物使用频率前十位，且协同使用时效果优于单味药物[7-8]。课题组前期通过黄芪丹参配伍提取物对MI模型大鼠进行干预后发现，联合使用可协同增强大鼠心脏舒缩功能，减少脑钠尿钛(brain natriuretic peptide,BNP)分泌，延缓心力衰竭[9]。在此工作基础上，课题组假设黄芪丹参配伍提取物可改善MI心肌功能并抑制心肌重塑，继续采用结扎冠状动脉左前降支复制MI大鼠模型，以研究黄芪丹参配伍提取物在体内对MI的积极作用和机制。

1 材料

1.1 动物

清洁级SD雄性8周龄大鼠(200±20 g)，购自河南省实验动物中心(动物生产许可证号SCXK(豫)2015-0005，动物质量合格证号1001297)，昼夜12 h交替饲养7 d(温度26 ℃±1 ℃、湿度55%±10%)。实验动物及方案均按照《实验动物护理和使用指南》[10]执行，并经南阳理工学院动物护理委员会的伦理准则批准进行(批准号：NYISTEEC-2017026)。

1.2 主要药物、试剂和仪器

实验中药材由南阳理工学院方药研究所提供并鉴定蒙古黄芪干燥根经和唇形科植物丹参干燥根经，提取方法参照国家自然科学基金项目“黄芪丹参配伍提取物对心肌梗死后心室重构中PKD-AP-1/C-Jun-MMPs信号传导通路影响的研究(81173372)”，黄芪每克含原生药33.36 g，黄芪总苷含量70.8%，丹参每克含原生药17.32 g，丹参总酚酸含量65.6%。肿瘤坏死因子-α(tumornecrosis factor-α，TNF-α)、转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)、白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)酶联免疫吸附测定试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)；蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶(v-akt murine thymoma viral oncogene homolog,Akt)、内皮一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)、核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)、B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、兔抗多克隆抗体(Anti-GAPDH rabbit polyclonal antibody，GAPDH)(北京博奥森生物技术有限公司)；原位细胞死亡检测试剂盒(福州市迈新生物技术开发公司)；HX-100E小动物呼吸机(成都泰盟科技有限公司)；动物超声成像仪(Vevo 3100，VisualSonics，Canda)；TKY-BMB石蜡包埋机、CUT6062病理切片机(深圳博大精科技实业有限公司)；荧光显微镜(DMIL-RF1，Leica,Germany)。

2 方法

2.1 建立MI大鼠模型

4%水合氯醛行腹腔注射麻醉大鼠，仰卧位固定于动物手术台。大鼠胸毛备皮消毒后，在胸骨上缘正中1 cm处纵切行气管插管，接通呼吸机以辅助呼吸。胸骨左缘第三肋间心尖搏动处切口，钝性依次分离肌层、胸膜，剪开心包膜后在左心耳右下缘中部和肺动脉圆锥部结扎。以肉眼可见心尖部颜色改变，心电图显示II导联QRS波群增宽、ST段弓背抬高，确定MI大鼠模型复制成功。假手术组穿线不结扎，大鼠模型成功后胸腔进行分层封闭缝合，术后为预防感染连续3 d腹腔注射青霉素80万单位。

2.2 分组及用药

存活3 d的大鼠随机分为黄芪丹参配伍提取物组[50 mg/(kg·d)]、假手术组(等量生理盐水)、模型组(等量生理盐水)各8只。尾静脉注射给药，连续3周后处死大鼠。

2.3 游泳疲劳时间

将大鼠置于自制水池中游泳(深度50 cm、面积1.5 m2、水温30 ℃±1 ℃、)，游泳疲劳时间定义为大鼠在泳池中运动协调性降低，连续下沉3次以上。

2.4 超声心动图测量

在药物干预的1、10、21 d采用30 MHz中频扫描头的高频超声系统评估心脏结构和功能。大鼠采用4%水合氯醛麻醉后，进行二维超声心动图测量，记录左室收缩末期直径(left ventricular end-systolic diameter,LVESd)、左室舒张末期直径(left ventricular end-diastolic diameter,LVEDd)、左室射血分数(left ventricular ejection fraction,LVEF)和左室缩短分数(left ventricular fractional shortening,LVFS)。

2.5 Masson染色法测量心肌纤维化

采集心脏后使用磷酸盐缓冲液清洗，固定于4%多聚甲醛。在不同浓度酒精脱水后嵌入石蜡包埋切片4 μm厚度。参照Masson操作说明持续染色处理，依次苏木素染色、伊红染色、苯胺蓝复染后脱水封片。染色后心肌样本中肌纤维呈现红色，胶原纤维呈现蓝色。显微镜下成像，使用Image J软件通过计算机平面测量法计算心肌纤维化。

2.6 酶联免疫吸附(ELISA)法测定促炎因子

ELISA法检测MI大鼠左心室心肌中TNF-α、TGF-β1、IL-1β的含量。取20 mg心肌样品在200 μL磷酸盐缓冲液(pH=7.4)中均质后置于-20 ℃储存过夜。进行冻融循环2次匀浆促使细胞膜破裂，5 000 r/min均速离心5 min后，按照试剂操作说明对样品进行测定。

2.7 TUNEL染色法测定凋亡细胞

采用原位细胞死亡检测试剂盒检测Bax蛋白和B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)的分布，心肌切片采用4’,6-联脒-2-苯基吲哚二盐酸盐(dihydrochloride,DAPI)溶液染色评估细胞核形态。在荧光显微镜下放大400倍对异硫氰酸荧光素标记的阳性细胞进行成像，在每片梗死边缘区随机选取3层，计算阳性细胞凋亡总数，采用Image Pro Plus软件进行计算。

2.8 蛋白质印迹法(Western blot)分析

采用超声、离心、热变形等方法从MI大鼠左心室心肌组织中提取总蛋白。蛋白质溶解物在12%聚丙烯酰胺凝胶电泳上电切分离后，转移至硝化纤维素膜上。室温下用5%脱脂牛奶封闭膜1 h后4 ℃冷藏用主要抗体培育过夜，包括兔抗Akt(1∶1 000)、兔抗磷酸Akt(1∶1 000)、兔抗eNOS(1∶1 000)、兔抗磷酸eNOS(1∶200)、兔抗NF-κB(1∶800)、兔抗Bax(1∶800)、兔抗Bcl-2(1∶800)、兔抗GAPDH(1∶1 000)。再将膜与辣根过氧化物酶结合的二级抗体(1∶500)置于室温下孵育1 h后洗膜，采用超信号ECL化学发光试剂盒检测。

2.9 统计分析

3 结果

3.1 MI模型大鼠游泳疲劳时间

与假手术组相比，模型组游泳一定时间后，运动协调性明显下降，出现疲劳时间较早(P<0.01)。与模型组相比，经过中药联合干预后的黄芪丹参配伍提取物组游泳时对抗疲劳效果明显，疲劳出现时间较晚(P<0.05)，如表1所示。

表1 各组MI大鼠游泳疲劳时间Table 1 Swimming fatigue time of MI rats in each

注：与假手术组相比**P<0.01，与模型组相比*P<0.05。

3.2 各组超声心动图观察

经黄芪丹参配伍提取物干预后，超声心动图监测结果显示该药对组合可显著改善MI大鼠心脏结构和心功能。在药物干预1 d，黄芪丹参配伍提取物组和模型组心功能相比较无明显差异。在21 d，与假手术组相比，模型组LVESd和LVEDd升高明显，而LVEF和LVFS明显降低；与模型组相比，黄芪丹参配伍提取物组LVEF和LVFS显著增高，LVESd和LVEDd明显降低，如图1所示。

3.3 心肌纤维化观察

经过Masson染色法检测MI大鼠心肌纤维化表现，发现黄芪丹参配伍提取物可有效降低心肌纤维化。结果表明，假手术组红色心肌组织排列较为规则清晰，心肌边缘处伴有少量蓝色胶原组织。与假手术组相比，模型组心肌组织排列明显紊乱，胶原纤维增多并已取代部分红色坏死心肌。与模型组相比，黄芪丹参配伍提取物组心肌排列整齐度占比较高，胶原纤维明显减少，如图2所示。

3.4 炎症细胞因子表达

与假手术组相比，模型组中TNF-α、TGF-β1、IL-1β和NF-κB表达水平明显升高(P<0.05)，说明心肌梗死后促炎细胞因子释放增多。与模型组相比，TNF-α、TGF-β1、IL-1β和NF-κB表达显著降低，有效抑制促炎细胞因子的释放，有利于MI的愈后，如图3所示。

3.5 心肌细胞凋亡测定

TUNEL染色后阳性细胞呈现绿色，经DAPI复染后细胞核蓝色。与假手术组相比，模型组心肌边缘区域凋亡细胞明显增多(P<0.05)。与模型组相比，经中药配伍联合干预后的黄芪丹参配伍提取物组细胞凋亡显著降低(P<0.05)。Western blot法检测Bax和Bcl-2蛋白含量结果显示，与模型组相比，Bcl-2蛋白表达以及Bax/Bcl-2比例均显著增加(P<0.05)，如图4所示。

与模型组相比*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001，与假手术组相比++P<0.01、+++P<0.001、++++P<0.0001 图1 各组MI大鼠超声心动图结果Fig.1 Echocardiographic results of MI rats in each group

3.6 Akt-eNOS信号表达

3组MI大鼠模型经Western blot法检测Akt-eNOS蛋白表达较相似。但与假手术组相比，模型组磷酸化Akt和磷酸化eNOS蛋白表达水平明显降低(P<0.05)；与模型组相比，黄芪丹参配伍提取物组可有效增加Akt和eNOS的磷酸化(P<0.05)，如图5所示。

4 讨论

在本次实验中，观察了黄芪丹参配伍提取物对MI大鼠的心脏保护作用，得到以下结论。

(1)通过黄芪丹参配伍提取物干预后，可以提高MI大鼠的运动耐力，改善心肌结构，减轻心肌纤维化和炎症水平。

图2 各组MI大鼠心肌纤维化影像(×200)Fig.2 Imaging myocardial fibrosis ofMI rats in each group(×200)

(2)通过提高Bcl-2和降低Bax蛋白含量发挥细胞抗凋亡作用，有效增加Akt-eNOS的磷酸化。实验结果表明，黄芪丹参配伍提取物能有效延缓MI后的心肌重塑进展。

与模型组相比*P<0.05，与假手术组相比+P<0.01、++P<0.01、+++P<0.001 图3 各组MI大鼠促炎细胞因子水平Fig.3 Levels of proinflammatory cytokines of MI rats in each group

与模型组相比*P<0.05，**P<0.01 图4 各组MI大鼠心肌细胞凋亡水平Fig.4 Apoptotic level of myocardial cells of MI rats in each group

与模型组相比*P<0.05 图5 各组MI大鼠Akt-eNOS信号表达Fig.5 Akt-eNOS signal expression of MI rats in each group

炎症细胞因子TNF-α、TGF-β1、IL-1β在MI的心肌纤维化病理发展中起着关键作用。NF-κB是重要的转录因子，参与诱导促炎细胞、内皮黏附因子、氧化应激酶等多个靶基因的表达。活化的NF-κB通过促进TNF-α、TGF-β1和IL-1β等表达激活心肌胶原纤维沉积，引发VR和HF，有研究报道通过抑制NF-κB能降低MI后的心肌损害[11]。在本次实验中再次证实了MI后可诱导TNF-α、TGF-β1和IL-1β的含量有所增加，采用黄芪丹参配伍提取物干预后明显降低这些炎性标志物的表达，说明黄芪丹参配伍提取物通过有效的抗炎作用有效保护心脏。心肌细胞的凋亡在MI和HF中起着重要作用，以往研究发现由缺血诱发的细胞凋亡导致自噬心肌细胞死亡以及心肌细胞在心肌缺血损伤过程中的丢失[12]。细胞凋亡主要特点是促凋亡Bax家族蛋白表达增加和抗凋亡Bcl-2家族蛋白表达减少，同时Bcl-2蛋白还可抑制转录因子NF-κB活性，说明细胞凋亡的扩增会引发纤维化表现，心肌细胞的凋亡在心肌纤维化发展中起着重要作用。本次实验研究显示，黄芪丹参配伍提取物可显著降低MI模型大鼠心肌边缘区细胞凋亡水平，此外还能有效上调Bcl-2蛋白并抑制Bax蛋白表达，表明黄芪丹参配伍提取物可通过对抗细胞凋亡减少心肌重塑。一氧化氮(NO)是参与血管内皮细胞生成的重要因子之一，eNOS作为维护血管内皮功能稳定的标志，在维持血管内皮完整性、血管舒张性和血管生成中具有重要作用。Akt和eNOS磷酸化通路途径的激活能积极促进NO的合成，通过调节血管重构和血管生成保护心肌缺血再灌注损伤[13]，如eNOS缺乏则可引起心肌细胞凋亡引发心力衰竭。本次实验研究观察到黄芪丹参配伍提取物可明显诱导MI大鼠模型心肌组织中Akt和eNOS磷酸化，表明通过该中药组合配伍干预后可通过激活Akt/eNOS通路对缺血性心肌组织产生积极的保护作用。

综上所述，本次实验研究表明黄芪丹参配伍提取物可有效预防MI后的心肌重塑，其潜在机制可能与抗炎、抗纤维化、对抗细胞凋亡和维护血管内皮功能稳定性有直接关系。实验中使用黄芪丹参配伍提取物显著改善了MI模型大鼠左心室形态结构和功能，但仍存在观察周期较短，能否联合其他药物方法配伍使用，尚需进一步观察揭示更多的作用途径。鉴于黄芪丹参配伍对缺血性心肌的保护作用认识不断加深，此药将作为新的治疗方法继续深入研究。