新生儿粪便中分离的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)RZ18提高肠道黏膜屏障完整性

李艳茹，张腾勋，郭聪聪，张同存，齐 威，王 楠

(天津科技大学生物工程学院，天津 300457)

联合国粮食及农业组织(Food and Agriculture Organization，FAO)和世界卫生组织(World Health Organization，WHO)对益生菌定义为一种活的微生物，在给予足够剂量时对宿主的健康起有益作用[1].益生菌仍然以乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)为主.乳酸菌是指能发酵糖，主要产生乳酸的一类细菌的总称．益生菌作为对机体有益的微生物，在预防和治疗多种肠道疾病方面广泛应用[2]，包括腹泻、肠易激综合征、新生儿坏死性小肠结肠炎、麸质不耐症、胃肠炎和复发的慢性肠炎等[3-5]．随着越来越多的证据表明益生菌对机体具有有益作用，益生菌菌株已经广泛应用于各种食品中，如酸奶、泡菜、米酒及婴幼儿益生菌产品．

婴幼儿时期是机体各项功能形成和完善的时期，也是肠道微生态形成的重要阶段．来自无菌动物的研究表明，体内定植的微生物对动物早期肠道形态发育、肠上皮细胞增殖、免疫系统分化等肠道发育过程有重要影响[6-7]．通过微生物干预，尤其是益生菌干预，有效地增强肠道的消化吸收能力，促进黏膜屏障、免疫快速成熟，进而提高机体防疫能力，对于婴幼儿的健康发育具有重要意义．因此，本研究旨在从新生儿粪便中分离筛选安全、有效的益生菌，为开发对肠道炎症疾病具有预防和治疗作用的新菌株提供实验依据．

肠黏液层是抵御肠内致病菌及有害物质入侵的第一道屏障，黏蛋白 2(mucin2，MUC2)是构成肠黏液层的最重要蛋白质，其数量及结构的改变与肠黏膜屏障损伤发生发展密切相关．肠上皮细胞紧密连接(tight junction，TJ)是肠黏膜屏障的重要组成部分，一旦 TJ受损，肠上皮细胞间的通透性增加，细菌内毒素和大分子物质就可通过紧密连接进入体循环，与多种疾病的发生发展有关．闭锁蛋白(occludin，OCLN)、封闭蛋白 1(claudin1，CLDN1)、闭锁小带蛋白 1(zonula occluden-1，ZO-1)是紧密连接中重要的3个蛋白[8]．因此研究从健康婴儿粪便中分离的LAB对此4种蛋白表达的影响，可反映该菌对促进肠道黏膜屏障完整性的作用及作用机制．

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品、细胞和菌株

出生一个月内婴儿的粪便样品由自天津蓝海兰母婴家政服务有限公司开发区分公司提供．SW620细胞，徐州医科大学惠赠．HT-29细胞，天津科技大学滕玉鸥老师惠赠．COS-7细胞，购自美国菌种保藏中心(ATCC)．藤黄微球菌(Micrococcus luteus)ATCC49732、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC25923、单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)CMCC54002、大肠杆菌(Escherichia coli)CMCC44102为本实验室保藏菌种．pMUC2-lucpGL3质粒本实验室构建．

1.1.2 试剂与仪器

MRS肉汤，北京奥博星生物技术有限责任公司；盐酸，天津市江天化工技术有限公司；牛胆盐，广东环凯微生物科技有限公司．DMEM/F12培养基、RPMI 1640培养基，Gibco公司；胎牛血清(FCS)，杭州四季青生物工程公司；M-MLV 逆转录酶、Trizol试剂，北京索莱宝科技有限公司；SYBR Green qPCR Mastermix，DBI Bioscience公司；dNTPs，北京康为世纪生物科技有限公司；Luciferase Assay System(E1501)，Promega 公司；claudin1(YT0942)一抗、ocludin(YN2865)一抗、zo-1(YN1410)一抗、MUC2 ELISA 检测试剂盒，ImmunoWay公司；甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)一抗，Santa Cruz公司；IRDye-800标记山羊抗小鼠二抗、IRDye-800标记山羊抗兔二抗，美国 Li-COR公司；TurboFect转染试剂，Thermo公司．

多功能酶标仪，美国Thermo有限公司；转膜仪，Bio-Rad公司；Odyssey双色红外荧光成像系统，美国LI-COR公司；stepone plus实时荧光定量PCR仪，美国ABI公司．DG 250厌氧培养箱，英国Don Whitley Scientifi(DWS)公司；pH 计，梅特勒-托利多仪器上海公司；DYY-6C型电泳仪，北京市六一仪器厂．

1.2 方法

1.2.1 菌株的分离、筛选

使用平板划线法对菌落进行纯化．将粪便样品梯度稀释到10-6涂布到添加碳酸钙的固体MRS培养基表面，37 ℃培养48h，挑选产生溶钙圈的菌落反复在 MRS培养基上划线，仔细鉴别不同菌落的形态特点并进行革兰氏染色．同时，将菌株用甘油管于－80℃冻存．提取基因组，对其进行 PCR扩增，将扩增产物送往金唯智生物科技有限公司测序，然后采用BLAST对结果进行16S rDNA比对．

耐酸能力测定：菌株于 MRS液体培养基中37℃厌氧培养箱培养，经过 3次活化，每次培养12h，对活化后得到的菌液离心收集菌体分别重悬于pH 为 2.0、3.0、4.0的液体 MRS培养基中[9]，调整菌体密度为5×108mL-1．取100µL菌液于96孔板中，每个样液做 3个复孔，同时以常规 pH MRS培养基组作为阴性对照．置于 37 ℃厌氧培养箱中培养4h．利用 MTT法，在 490nm 处测定吸光度(A)，按照式(1)计算存活率[10-11]．

耐胆盐能力测定：菌株于 MRS液体培养基中37℃厌氧培养箱培养，经过 3次活化，每次培养12h，对活化后得到的菌液离心收集菌体重悬于含0.1%～0.3%胆盐的液体MRS培养基中[12]，调整菌体密度为5×108mL-1．置于37 ℃培养箱中培养4h．按照1.2.2节的方法测定存活率[13]．

1.2.2 菌株活化、样品制备及细胞培养

将保存在－80℃菌种常温下解冻，于 2%接种于MRS液体培养基中，经过2次活化，每次培养12h，最终接菌于 100mL培养基中，同时以 100mL空白培养基为对照组，12h后离心，取上清液，50℃旋蒸1.5h左右，倒入玻璃培养皿中，放入-80℃冰箱24h，于冻干机中冻干处理．冻干样品重悬于细胞培养基中．

HT-29、COS-7细胞用含 10% FCS 的 F12培养基(含 1×105U/L青霉素和 100mg/L链霉素)，SW620用含10% FCS 的RPMI 1640培养基(含1×105U/L青霉素和 100mg/L链霉素)，在 37 ℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养，24h后换液，以后每 2、3d更换1次培养液．细胞长满后，用2.5g/L胰酶消化后传代．

1.2.3 结肠细胞黏附能力测定

SW620细胞以 104mL-1的密度均匀铺种在 96孔板中培养 2d，将已长至单层的人结肠癌细胞SW620用灭菌的 PBS(pH 7.4)漂洗 2次，将 100µL乳酸菌(5×108mL-1)加入96孔细胞板中，37 ℃、5%CO2培养箱中孵育1h后，用灭菌的PBS漂洗3次，以洗去未黏附的菌．应用MTT法分别测定PBS漂洗后的益生菌(A黏附菌)、未漂洗的益生菌(A总菌)及未加菌空白对照(A对照)孔的吸光度，按照式(2)计算黏附率．

1.2.4 酶联免疫吸附(ELISA)实验

HT-29细胞以 104mL-1的密度均匀铺种在 6孔板中培养 2d，经加入 5mg/mL 冻干的发酵液的上清液处理24h后，收集细胞培养基上清液，采用酶联免疫吸附法检测细胞培养基上清液中 MUC2水平，试剂盒采用人 MUC2ELISA检测试剂盒．检测方法按说明书进行．

1.2.5 荧光素酶活性检测

以 104mL-1密度均匀铺种 COS-7 细胞于 24孔板中，铺种24h后用TurboFect转染试剂对pMUC2-luc质粒进行转染，转染6h后换液，并将已处理的样品以5mg/mL的浓度加入已转染质粒的24孔板培养基中．继续培养24h后，弃去上清液，在24孔板每孔加入100µL的裂解液，裂解30min，再用细胞刮刀刮下细胞，将裂解的蛋白50µL加入白色96孔板中，同时加入荧光素酶化学发光底物 100µL，迅速放入酶标仪中进行检测其荧光值．

1.2.6 实时荧光定量PCR(Real-time PCR)

HT-29细胞以 104mL-1的密度均匀铺种在 6孔板中培养 2d，经加入 5mg/mL 样品处理 24h后，Trizol法提取HT-29细胞中RNA，用M-MLV逆转录酶逆转录 2µg样品．Real-time PCR法检测 MUC2、OCLN、CLDN1、ZO-1基因的表达．PCR 体系：10µL DDW，7.6µL Mix，0.4µL Rox，0.5µL 上游引物，0.5µL下游引物，1µL cDNA模板．PCR反应条件：95℃预变性 2min，95℃变性 10s，60℃退火和延伸30s，共 40个循环，95℃终止反应 15s．所用引物见表 1．

表1 引物Tab. 1 Primers

1.2.7 免疫印迹(Western blot)

HT-29细胞以 104mL-1的密度均匀铺种在 6孔板中培养 2d，经加入 5mg/mL样品处理 24h后，收集总蛋白．蛋白进行电泳、转膜，浸入封闭液中封闭1h．分别加稀释后的 ZO-1一抗(1﹕1000)、CLDN1一抗(1﹕1000)、OCLN 一抗(1﹕1000)和 GAPDH一抗(1﹕3000)，4 ℃孵育过夜，山羊抗兔(1﹕10000)或山羊抗鼠(1﹕10000)二抗室温下避光孵育1.5h，将 NC膜平铺于远红外成像仪中，设置程序扫膜，保存数据．

1.2.8 抑菌能力检测

取 106mL-1的 M.luteus、L.monocytogenes、S.aureus、E.coli菌悬液 50µL作为指示菌(菌体浓度为 108mL-1)，涂布于已凝固的琼脂平板上，平衡30min．无菌操作：将 3只无菌牛津杯(直径 8cm)轻轻放在平板上，杯内分别加入106mL-1的RZ18菌悬液、MRS培养基 30µL．平放 37℃孵箱培养 16～18h，观察抑菌圈的大小，抑菌圈直径＞8mm，则判断为敏感菌株，表明有抑菌效果[14]．

1.3 统计学分析

实验数据结果以“平均值±标准差”表示，数据由 Graphpad Prism 5.0进行统计分析，*、**分别表示有统计学差异P＜0.05、P＜0.01．

2 结果与分析

2.1 LAB耐酸能力

对从新生儿粪便中分出的15株LAB的耐酸、耐胆盐及细胞黏附进行初步检测，筛选出5株相对抗逆性较好的 LAB，分别是粪肠球菌(Enterococcus faecalis)RZ18和 RZ002、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)RZ003和RZ004、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)RZ005．人体胃液pH通常为2.0左右，随进食时间延长，逐渐上升至pH 5.0左右，胃排空时间一般为 3～4h．要成为食源性的益生菌，应该具有一定的耐酸性．对 5株菌的耐酸能力进行检测，结果如图 1所示．

图1 5株乳酸菌耐酸能力分析Fig. 1 Acid resistance analysis of the five LAB strains

在pH 2时，L.casei RZ003和RZ004存活率均较低，分别为(12.41±0.13)%和(11.27±0.12)%，其他3种菌 E.faecalis RZ18、RZ002以及 P.acidilactici RZ005存活率在 20%左右．在 pH 3时，L.casei RZ003存活率最低，仅为(13.69±0.24)%，其他 4种菌 E.faecalis RZ18、RZ002 和 L.casei RZ004、P.acidilactici RZ005存活率在20%左右．在pH 4时，L.casei RZ004存活率最高，可达(72.64±0.11)%，其他4种菌E.faecalis RZ18、RZ002和L.casei RZ003、P.acidilactici RZ005存活率均在40%～50%．

2.2 LAB耐胆盐能力

人体肠道内胆汁浓度是变化的，胆盐含量总体在0.03%～0.3%的范围内波动．本研究中研究了 5株LAB对 0.1%、0.2%、0.3%胆盐的耐受能力进行分析．结果如图 2所示，在含有 0.1% 胆盐培养基中培养 4h后，E.faecalis RZ18和 RZ002、P.acidilactici RZ005存活率在 100%以上，说明在 0.1%的胆盐环境中并不会影响这 3株菌的生长．在含有 0.2%胆盐培养基中培养4h后，P.acidilactici RZ005存活率最高，可达(57.2±1.57)%，其他 4株菌均在 25%～35%. 在含有0.3%胆盐培养基中培养4h后，各菌存活率相差不大，均在20%～35%．

图2 5株乳酸菌耐胆盐能力分析Fig. 2 Analysis of bile salt tolerance of the 5 LAB strains

2.3 LAB黏附能力

LAB在肠道的黏附定植部位主要发生在结肠，因此本研究采用人结肠癌细胞 SW620模拟肠道环境，通过 MTT法测定不同 LAB对结肠细胞黏附能力的差异．结果如图3所示，E.faecalis RZ18、RZ002和 P.acidilactici RZ005的黏附能力较强，其中P.acidilactici RZ005最强为(51.96±9.06)%．

图3 5株乳酸菌对人结肠癌细胞的黏附能力分析Fig. 3 Adhesion analysis of the five LAB strains to human colon cancer cells

2.4 LAB发酵上清液对 HT-29细胞中 MUC2蛋白表达的上调作用

黏蛋白(MUC)是由体内多种上皮细胞分泌的大分子糖蛋白，包括 MUC2、MUC5AC、MUC5B、MUC6-7、MUC1、MUC3-4、MUC13 和 MUC17 等多个亚型．MUC2属于分泌型黏蛋白，在肠道的表面形成黏液层发挥润滑和拮抗致病菌的肠道黏附和侵袭的作用，是黏液屏障中重要蛋白之一．MUC2表达量的上调表明其黏液屏障更加完善．5mg/mL发酵上清液处理HT-29细胞24h后，利用ELISA方法检测细胞培养基中 MUC2的含量，结果如图 4所示，E.faecalis RZ18发酵上清液可使MUC2蛋白的表达量上调，与对照组相比，具有统计学意义(*P＜0.05)．

图4 5株乳酸菌发酵上清液对MUC2蛋白表达的影响Fig. 4 Effect of fermentation supernatant from the five LAB strains on MUC2 protein expression

2.5 E. faecalis RZ18发酵上清液增强 MUC2启动子活性及转录水平

利用 E.faecalis RZ18菌株发酵上清液处理COS-7细胞同时转染 pMUC2-luc质粒，采用荧光素酶报告基因检测方法检测 MUC2启动子活性，结果如图5所示，E.faecalis RZ18发酵上清液可显著上调MUC2的启动子活性(*P＜0.05)．

图5 E.faecalis RZ18发酵上清液对 MUC2启动子活性的影响Fig. 5 Effect of E.faecalis RZ18 fermentation supernatant on the promoter activity of MUC2

用E.faecalis RZ18菌株发酵上清液处理HT-29细胞 24h后，Real-time PCR方法检测 MUC2的mRNA水平，结果(图6)发现 E.faecalis RZ18发酵上清液能显著上调MUC2mRNA的水平(*P＜0.05).这些结果进一步证实E.faecalis RZ18的发酵上清液可以促进MUC2的转录水平升高．

图6 E.faecalis RZ18发酵上清液对 MUC2 mRNA水平的影响Fig. 6 Effect of E.faecalis RZ18 fermentation supernatant on the mRNA level of MUC2

2.6 E.faecalis RZ18发酵上清液上调 OCLN、CLDN1、ZO-1蛋白的表达水平

肠黏膜通透性的变化与肠黏膜紧密连接蛋白的一系列改变有关，提高肠道ZO-1和OCLN mRNA及其蛋白水平的表达，可增强其肠道屏障功能[15]，CLDN1表达水平下调可以作为评价肠道黏膜屏障功能是否发生障碍的重要指标[16]．利用RZ18菌株发酵上清液处理HT-29细胞24h后，利用Real-time PCR和WB方法检测OCLN、CLDN1、ZO-1的mRNA和蛋白水平，结果如图7和图8所示．

图7 E.faecalis RZ18发酵上清液对 CLDN1、OCLN、ZO-1 mRNA水平的影响Fig. 7 Effect of E.faecalis RZ18 fermentation supernatant on the mRNA level of CLDN1，OCLN and ZO-1

图8 E.faecalis RZ18发酵上清液对 CLDN1、OCLN、ZO-1蛋白水平的影响Fig. 8 Effect of E.faecalis RZ18 fermentation supernatant on the protein level of CLDN1，OCLN and ZO-1

结果表明，E.faecalis RZ18发酵上清液可显著上调紧密连接蛋白CLDN1、OCLN、ZO-1的mRNA水平，与对照组相比，具有统计学意义(*P＜0.05，**P＜0.01)．同时，E.faecalis RZ18发酵上清液可显著上调紧密连接蛋白 CLDN1和 OCLN的蛋白水平(*P＜0.05)，也可增加 ZO-1的蛋白水平，但与对照组相比差异不显著．

2.7 E.faecalis RZ18对M.luteus、S.aureus、L.monocytogenes、E.coli的抑制作用

利用牛津杯法检测RZ18对M.luteus、S.aureus、L.monocytogenes、E.coli等 4种致病菌的抑制作用，结果表明：RZ18对 S.aureus、M.luteus、L.monocytogenes、E.coli有不同程度的抑制作用，其中对M.luteus、E.coli抑制效果较差，抑菌圈直径仅为(17±0.30)mm、(17±0.25)mm；对 L.monocytogenes抑菌圈直径为(18±0.23)mm；对 S.aureus抑制效果最明显，抑菌圈直径达(21±0.16)mm．M.luteus、S.aureus、L.monocytogenes是革兰氏阳性菌，E.coli为革兰氏阴性菌，因此，E.faecalis RZ18对革兰氏阳性和阴性菌均有一定抑制作用．

3 讨 论

益生菌可通过调节肠道菌群、增强机械屏障、调节肠黏膜免疫功能，从而在生物屏障、机械屏障、免疫屏障 3个层次增强肠黏膜屏障．婴儿时期是肠道菌群建立的关键时期，若此时肠道菌群构造合理、代谢平衡，那么今后机体肠道屏障发育将更加完善，进而为机体减少各种代谢类疾病风险[17-19]．动物研究表明，鼠李糖乳杆菌GG能够增强新生小鼠肠上皮细胞的增殖、迁移、分化、屏障功能的形成[20]．李碧莹[21]发现通过对婴幼儿口服益生菌，能有效调节胃肠道细菌的生长及繁殖，改善胃肠菌群失衡状况，同时能够维持肠细胞的完整性，修复因感染轮状病毒所致肠黏膜损伤，加速恢复胃肠黏膜屏障正常功能，从而提高对婴幼儿轮状病毒性腹泻的临床疗效．由于婴幼儿肠道屏障发育与体内定植益生菌关系密切，因此本研究选用新生儿粪便作为菌种来源，希望可以获得更安全、能在机体定植、具有促进肠道屏障发育和完整性的新型益生菌．本研究从新生儿粪便中分离出一株具有促进肠道黏液 MUC2表达的菌株E.faecalis RZ18．

Claudin1是紧密连接跨膜蛋白，对维持肠上皮细胞屏障功能和紧密连接的完整性具有重要作用，细胞旁 Claudin蛋白作为细胞间紧密联接通道，具有电通道的作用．跨膜蛋白 Occludin可增强成纤维细胞间的黏附性，增加跨膜电阻[22]，调节细胞间的通透性[23].研究[24]表明，肠致病菌及其毒素通过下调 Occludin蛋白表达的途径破坏TJ结构．ZO-1是构成紧密连接的重要成分之一，能与其同源体 ZO-2、ZO-3一起为紧密连接的许多跨膜蛋白和细胞质紧密连接蛋白搭建具有连接作用的脚手架样平台．多数情况下只要ZO-1受到破坏，紧密连接的功能大多会随之发生变化，而 ZO-1蛋白增加，提示其能增强上皮组织的紧密连接以及结构的完整性，使肠道上皮细胞组织的选择性通透性增强，因此 ZO-1常被用来作为观察机体内各种组织的紧密连接屏障功能和通透性功能的指标．本研究发现粪肠球菌 RZ18能上调 Claudin1、Occludin、ZO-1的水平，说明婴幼儿体内早期定植的粪肠球菌可能对于肠道屏障的完整性具有一定的促进作用．

长期的科学研究表明，人类肠道中广泛存在的乳酸菌在膳食应用上具备良好的安全性[25]．临床研究最多的乳酸菌是双歧杆菌和乳酸杆菌，粪肠球菌和某些非致病性芽胞杆菌及兼性厌氧地衣芽胞杆菌也有所涉及．粪肠球菌被认为是一种条件致病菌，在人的免疫力低下或大量使用抗生素时可导致尿路感染、心内膜炎、腹膜炎、伤口感染等疾病[26]，但在一般情况下对人体和动物是没有危害的，属于人和动物体内的常在菌，并能有效抑制有害菌，增殖有益菌，可作为益生菌制剂组方发挥药理作用．目前对于粪肠球菌作为益生菌在人和动物体内的作用和应用已有一些相关报道．Tinrat等[27]分离出一株具有较好的抑菌效果的粪肠球菌 MTC1032，该菌株通过产酸和细菌素有效抑制了多种病原菌，具有抑菌性，并能够在酸性条件下生存．在安全性评价中，MTC1032能够黏附于宿主上皮细胞，并能明显抑制病原细菌黏附.Zheng等[28]研究采用含婴儿双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌和蜡样芽胞杆菌的益生菌组合，通过高通量测序监测血液指标和微生物多样性，减少胃切除术引起的生理障碍．他们认为益生菌联合用药通过改变肠道菌群，显著增强患者的免疫应答，减轻炎症的严重程度．薛胜平等[29]用酪酸菌、肠膜芽胞杆菌和粪肠球菌组方制备益生菌制剂，药理作用是调节肠道菌群，增殖有益菌如双歧杆菌、乳杆菌等，抑制有害菌，从而有整肠作用．甘利平等[30]在鸡的饲粮中添加粪肠球菌虽对肉仔鸡的生长性能没有显著影响，但可改善肠道健康，尤其对早期鸡只肠道的健康生长起到促进作用．董正林[31]研究发现日粮中添加微囊化粪肠球显著提高了一定日龄肉鸡平均体质量，并显著增加肉鸡肝脏指数及肉鸡血清 IgA、IgM 含量，且显著增加肉鸡盲肠乳酸杆菌数量和降低肉鸡盲肠大肠杆菌数量．魏清甜[32]研究发现，添加 200g/t的粪肠球菌能够显著改善试验仔猪保育前期平均日增质量、料重比、腹泻率和保育后期的平均日采食量，能够增强体液免疫性能，明显提高保育仔猪对饲料中粗蛋白和粗脂肪的表观消化率，并对仔猪的肠道发育有一定的促进作用，可降低空肠中 E.coli的数量，促进仔猪盲肠微生态的平衡．

本研究从新生儿粪便中分离出一株粪肠球菌E.faecalis RZ18，其对多种致病菌有一定的抑制作用，并且对肠道黏膜屏障中重要的蛋白 MUC2、CLDN1、OCLN、ZO-1表达有上调作用，有望应用于小儿或成人炎症性肠病的预防与治疗．同时，研究证实婴幼儿体内早期定植的粪肠球菌可能对婴儿肠道黏膜屏障完整性的发育有促进作用，这为开发相应益生菌制剂及功能食品提供了参考依据．