丁酸梭菌早期干预对大肠杆菌攻毒肉鸡肠道炎症因子和抗菌肽基因表达的影响

2020-06-23申露露肖英平桂国弘吕文涛任敏敏

中国饲料 2020年7期

申露露，徐娥*，肖英平，桂国弘，吕文涛，任敏敏

（1.贵州大学动物科学学院，贵州贵阳 550025；2.浙江省农业科学院农产品质量标准研究所，浙江杭州310021）

近年来，产肠毒素大肠杆菌是畜牧养殖中诱发初生动物腹泻，从而导致动物死亡的重要致病菌，给畜牧养殖业带来巨大损失。丁酸梭菌（Clostridium butyricum）作为重要的益生菌之一（Liao等，2015），其能够促进有益菌群的增殖，抑制有害菌群的生长、繁殖（朱晓慧等，2002），并于2009年被批为一种新的饲料添加剂（桂国弘等，2016）。 Yang（2012）等报道，日粮中添加丁酸梭菌可降低肉鸡盲肠中大肠杆菌的数量，提高肉鸡盲肠中双歧杆菌和乳酸杆菌的数量。丁酸梭菌对畜禽感染大肠杆菌具有保护作用（邢帅等，2018）。另有研究表明，丁酸梭菌能抑制机体中促炎性因子的表达，提高抗炎性因子IL-10的表达（Liu 等，2017）。赵敏孟等（2018）提出丁酸梭菌提高畜禽免疫力与血清细胞因子含量和抑制肠道炎症的发生有关。但丁酸梭菌早期干预对肉鸡抵抗大肠杆菌感染和肠道炎症反应的影响还鲜见报道。本试验用丁酸梭菌作早期干预，通过ETEC攻毒，研究丁酸梭菌对雏鸡大肠杆菌感染攻毒后死亡率和下痢率以及肠道炎症因子和抗菌肽基因表达的影响，为丁酸梭菌作为畜牧业生产中预防大肠杆菌引起的疾病提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料丁酸梭菌MIYAIRI II 588，购自日本米雅利桑株式会社；产肠毒素大肠杆菌K88（菌株编号：CVCC1556），购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心。

1.2 试验设计与饲养管理试验设计和分组情况如表1所示，试验选用200只健康1日龄肉鸡（ROSS308，购自江苏镇江腾达孵化厂），随机分为2组，每组100只鸡，分别为丁酸梭菌组和对照组，在1～3 d时每天对丁酸梭菌组灌喂1 mL浓度为109cfu/mL的丁酸梭菌菌液，对照组灌喂1 mL生理盐水。到7 d时把丁酸梭菌组再随机分为丁酸梭菌组（CB组）和丁酸梭菌+大肠杆菌组（CB+EC组），同时对照组也随机分成大肠杆菌组（EC组）和对照组（Control组），在7 d时对丁酸梭菌+大肠杆菌组（CB+EC组）、大肠杆菌组（EC组）每天灌喂1 mL 108cfu/mL大肠杆菌液，其余组灌喂1 mL生理盐水。

表1 试验处理情况

试验在浙江省农业科学院动物房进行，试验前对动物房全舍及饲养设备进行严格消毒，饲养周期为14 d。试验为自由采食，自由饮水，人工投料，每天投喂3次，24 h光照，使用白炽灯调节动物房室内温度，第一周温度保持37℃，之后每周逐渐减低2～3℃直至室温。基础日粮组成和营养成分如表2所示。

表2 日粮组成及主要营养成分

1.3 样品采集在肉鸡大肠杆菌攻毒第3天（第10日龄）和第7天（第14日龄），从各试验组随机取8只肉鸡，取回肠组织中段放入1.5 mL离心管中，液氮速冻后转置于-80℃超低温冰箱保存，用于炎症因子和抗菌肽基因表达分析。

1.4 荧光定量PCR 采用TRIzol Plus RNA Purification Kit（Invitrogen）试剂盒提取回肠组织RNA，用Nanodrop-2000测定所提取RNA的浓度和质量，采用SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix for qRT-PCR（Invitrogen公司）反应体系进行逆转录。所用引物相关信息见表3。以GAPDH为内参基因进行荧光定量PCR测定，按照 Power SYBR○RGreen PCR Master Mix试剂盒（TaKaRa），采用CFX96荧光定量PCR仪（美国Bio-Rad）进行Real-Time PCR检测。反应体系为20μL；反应条件为95℃预变性1 min；40个循环（95 ℃变性 15 s，63 ℃退火 25 s，收集荧光）。

表3 实时荧光定量PCR引物

1.5 统计分析使用SPSS软件单因素方差分析进行数据统计分析，基因相对表达量运用2-△△Ct法计算，结果以“平均数±标准误”表示。

2 结果

2.1 丁酸梭菌对大肠杆菌攻毒肉鸡死亡率和下痢率的影响如表4所示，灌喂丁酸梭菌的雏鸡未出现死亡情况，对照组和大肠杆菌组中雏鸡死亡率为3%。各组雏鸡在灌喂大肠杆菌后均出现了下痢的情况，其中大肠杆菌组下痢率为73.52%，大肠杆菌+丁酸梭菌组下痢率为29.41%，可见丁酸梭菌可显著降低大肠杆菌攻毒引起的腹泻。

表4 丁酸梭菌对大肠杆菌攻毒肉鸡死亡率和下痢率的影响%

2.2 丁酸梭菌对大肠杆菌攻毒肉鸡回肠炎症因子表达的影响如图1所示，攻毒3 d后肉鸡回肠组织炎症反应相关基因TNFα、白细胞介素1β（IL-1β）的表达量在各组无显著差异（P＞0.05），丁酸梭菌组 Toll样受体 4（TLR4）和白细胞介素8（IL-8）的表达量显著低于大肠杆菌组和大肠杆菌+丁酸梭菌组（P＜0.05）。而丁酸梭菌组和大肠杆菌+丁酸酸梭菌组抗炎症因子白细胞介素10（IL-10）的表达量显著高于大肠杆菌组（P ＜ 0.05）。

攻毒7 d后结果如图2所示，回肠组织炎症反应相关基因TNFα、IL-1β和IL-8的表达量各组间无显著性差异（P＞0.05）。大肠杆菌组与丁酸梭菌组＋大肠杆菌组TLR4的表达量显著高于对照组和丁酸梭菌组（P＜0.05）。大肠杆菌组抗炎因子IL-10的表达量显著低于其他各组（P＜0.05）。

2.3 丁酸梭菌对大肠杆菌攻毒肉鸡回肠内源性宿主防疫肽表达的影响如图3所示，在攻毒3 d后AvBD9和Cath-B1在回肠组织中的表达量各组间无显著差异（P＞0.05），而丁酸梭菌组AvBD10表达量极显著的高于其他各组（P＜0.01）。

攻毒7 d后回肠组织内源性宿主防御肽表达结果如图4所示，丁酸梭菌组与大肠杆菌组回肠组织中AvBD9的表达量显著高于其他组（P＜0.01），Cath B1表达量各试验组均显著高于对照组（P＜0.01）。AvBD10在各组无显著性差异（P＞0.05），但丁酸梭菌组和丁酸梭菌+大肠杆菌组的表达量较高。

3 讨论

3.1 丁酸梭菌对大肠杆菌攻毒肉鸡死亡率和下痢率的影响 ETEC是一种引起初生幼畜腹泻的主要病原体。ETEC入侵肠道后，会引起肠道功能紊乱，进而导致急性腹泻（Dubreuil等，2016）。邢帅（2018）等研究表明，丁酸梭菌对仔猪感染大肠杆菌引起的应激反应有保护作用。本试验结果也显示丁酸梭菌作为一种益生菌，可以降低雏鸡因大肠杆菌引起的下痢，与前人研究结果一致（李海花等，2017；Hayakawa 等，2016）。丁酸梭菌可能是抑制了雏鸡肠道内大肠杆菌的黏附素和肠毒素的表达，降低雏鸡的腹泻。

3.2 丁酸梭菌对大肠杆菌攻毒肉鸡回肠组织中炎症因子表达的影响动物机体炎症反应主要是由于血清中抗炎性因子和促炎性因子失调导致的。有研究表明，在动物饲粮中添加益生菌可调节血清中抗炎性因子和促炎性因子的表达，对动物机体炎症反应有改善作用（李玉鹏等，2017）。丁酸梭菌可以增强机体免疫功能，主要是通过特异性受体调控基因的表达，调节机体的免疫通路（杨玲等，2018）。在本试验回肠组织中，10 d时TNFα、IL-1β无显著性差异（P＞0.05），相比EC组与CB+EC组，丁酸梭菌组IL-8基因的表达量显著降低（P＜0.05），而IL-8是导致机体炎症反应促炎性因子，IL-8的表达量降低，说明丁酸梭菌可以调控IL-8的表达来改善机体炎症反应；同时与CB组相比，大肠杆菌组炎症抑制因子IL-10的表达量显著降低（P＜0.05），丁酸梭菌能促进炎症抑制因子的表达，与李玉鹏（2017）等研究一致；14 d时 TNFα、IL-1β、IL-8 没有显著性差异（P ＞0.05）。与CB＋EC组相比，大肠杆菌组IL-10的表达量显著降低（P＜0.05），同时这段时间肉鸡的腹泻情况有所好转，表明丁酸梭菌对大肠杆菌攻毒肉鸡引起的腹泻有一定改善作用。因此，丁酸梭菌早期干预可以提高雏鸡血清中抗炎性因子的表达，同时抑制促炎性因子的表达。

3.3 丁酸梭菌对大肠杆菌攻毒肉鸡回肠内源性宿主防疫肽表达的影响宿主防御肽（HDPs），又被称作抗菌肽（AMPs），大多由20～100个氨基酸组成，广泛表达于动植物的各个组织中（Shafee等，2016；Schneider等，2010）。宿主防御肽在免疫系统中发挥着重要作用，对各种病原物质具有广谱抗性，能直接杀灭各种细菌、病毒、真菌等（张龙等，2017）。同时，宿主防御肽具有强大的免疫调节作用，能够调节免疫细胞和炎症反应。因此，宿主防御肽具有很高的应用价值，可直接作为抗菌剂或者疫苗辅剂，或者作为免疫及生殖调控剂等（Hancock 等，2012；Skerlavaj等，1996）。宿主防御肽作为一种免疫调节剂，在病原菌感染机体时，肠道内抗菌肽基因会相应的表达（Su等，2018）。本研究结果可以看出在大肠杆菌攻毒后的第3天，丁酸梭菌组AvBD10的表达量显著高于其他试验组，而AvBD9和CathB1在各个试验组之间没有显著差异，可能原因是丁酸梭菌早期定植在雏鸡体内主要调节AvBD10的表达，有研究表明AvBD10 mRNA在鸡的卵黄囊上皮细胞中高度表达，参与先天免疫（Zhang等，2019）。攻毒后第7天，丁酸梭菌组与大肠杆菌组AvBD9在回肠组织的表达量显著增加（P＜0.01），试验组CathB1表达量相对于对照组显著增加（P＜ 0.01），在三个试验组中都无显著性差异。AvBD10在各组中都无显著性差异（P＞0.05），而丁酸梭菌组与丁酸梭菌+大肠杆菌组的 AvBD10表达量都高于对照组与大肠杆菌组。从总体结果可以看出丁酸梭菌可以提高雏鸡肠道抗菌肽基因的表达，对大肠杆菌早期攻毒肉鸡肠道有一定的保护作用。