正交设计优化微波提取杏鲍菇黄酮研究

2020-06-23李建凤廖立敏

中国饲料 2020年7期

李建凤，黄茜，廖立敏 *

（1.内江师范学院化学化工学院，四川内江641100；2.四川省高等学校“果类废弃物资源化”重点实验室，四川内江641100）

杏鲍菇含蛋白质、碳水化合物、维生素和钙、镁、铜、锌等多种营养成分，此外还含有多糖、多肽、酚类、海藻糖等活性物质，具有促进肠胃消化、防止心血管疾病及提高免疫力等功效（刘鹏等，2011；潘崇环等，2004）。杏鲍菇主要作为食材被利用，对它的研究大多集中在栽培技术（Shoji等，2014；李月梅等，2012）、病虫害防治（Russo 等，2013）、加工工艺及营养成分（Carbonero 等，2016；李志豪等，2009）等方面，有关其生物活性成分的提取及性质研究较少，仅见于蛋白质、多糖等（钟耀广等，2007）。黄酮类化合物是普遍存在于植物、食用菌中的一类生物活性成分，具有抗氧化、增强免疫、抗感染、抗菌、抗病毒、抗过敏等多种生物活性；另外，黄酮类化合物对动物的生产性能有明显的促进作用，其作为饲料添加剂有助于动物的健康育肥、提高免疫力、减少抗生素使用等，对于提高肉类品质具有重要意义，因此受到学者的广泛关注（张冰溪等，2017；郝斯佳等，2015；冯香安等，2011；张平平等，2011）。目前，黄酮类化合物的提取方法主要有溶剂提取法、超临界流体萃取法、微波提取法、超声波提取法、双水相萃取分离法、酶解法、半仿生提取法等（李淑荣等，2018；张伟等，2014；林英男等，2014；Pan 等，2012）。其中，微波提取法具有耗时短、能耗低、得率高等优点（杨京霞等，2015）。本文采用微波提取法提取杏鲍菇中的黄酮类化合物，通过试验探究乙醇体积分数、液料比、微波功率及微波时间对杏鲍菇黄酮提取的影响，利用正交设计对试验条件进行优化，对于开发利用杏鲍菇黄酮具有一定的参考价值。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器杏鲍菇粉（杏鲍菇烘干后粉碎获得），无水乙醇、95%乙醇、氢氧化钠、硝酸铝、亚硝酸钠，均为分析纯。

电子分析天平（JA2003A），上海精天电子仪器有限公司；紫外可见分光光度计（UV-mini-1240），岛津制作所；中药高速粉碎机（DFT-100），温岭市林大机械有限公司；电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9245A），上海一恒科学仪器有限公司；低速大容器离心机（DTL-5-A），上海安亭科学仪器厂；优质超纯水机（UPT-Ⅱ-10T），四川优普超纯科技有限公司；微波·紫外·超声波三位一体合成萃取反应仪（UWave-1000），上海新仪微波化学科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 黄酮的提取新鲜市售杏鲍菇洗净，60℃下烘干至恒重，高速粉碎机粉碎3 min，得到杏鲍菇粉末，置于干燥器中备用。准确称取1.000 g杏鲍菇粉末于反应瓶中，加入一定量一定体积分数的乙醇，置于微波提取仪中，在一定的功率下提取一定的时间。提取后离心得到滤液，稀释至50 mL得黄酮待测液。

1.2.2 芦丁标准曲线及样品测定精密称取芦丁标准品0.0200 g，60%的乙醇溶解，转移至50 mL容量瓶，60%乙醇定容，即得质量浓度为400μg/mL芦丁标准液（王勇等，2009）。准确移取芦丁标准液1.0 mL于25 mL比色管中，加入5%亚硝酸钠1.0 mL，混匀，静置6 min，加入10%硝酸铝1.0 mL，混匀，静置6 min，加入4%氢氧化钠10.0 mL，60%乙醇稀释至刻度线，混匀，静置15 min，在300～900 nm测定吸收光谱，得最大吸收波长为510 nm。

分别精密移取芦丁标准液 0.0、1.、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL至25 mL的比色管中，60%乙醇稀释配制成 0.00、16.00、32.00、48.00、64.00、96.00 μg/mL的标准系列。以芦丁空白液作参比，在波长为510 nm处测定吸光度，以吸光度A为横坐标，以芦丁标准液浓度C（单位μg/mL）为纵坐标，作线性回归得芦丁标准曲线：C=0.0011+0.01007A，R2=0.9997。

待测液适当稀释后移取2 mL，按上述步骤测定吸光度，计算杏鲍菇黄酮的得率。

1.2.3 试验设计单因素试验：准确称取1.000 g杏鲍菇粉末于反应瓶中，对乙醇体积分数、液料比、微波功率和微波时间4个因素进行考察，固定其中3个因素处于中间水平，改变第4个因素进行单因素试验。

正交试验：选择乙醇体积分数、液料比、微波功率、微波时间为考察因素，在单因素试验的基础上设计各因素的水平，因素及水平见表1。

表1 正交试验设计

2 结果与讨论

2.1 单因素试验乙醇体积分数对杏鲍菇黄酮提取的影响见图1。在固定液料比40 mL/g、微波时间4 min、微波功率600 W的条件下，乙醇体积分数分别取40%、50%、60%、70%、80%进行试验，杏鲍菇黄酮的得率随着乙醇体积分数增大而增大，当乙醇体积为70%时杏鲍菇黄酮得率接近最大值。黄酮类化合物具有一定的极性，随着乙醇体积分数的增加，乙醇溶液的极性在逐渐改变，乙醇体积分数为70%时乙醇溶液的极性与黄酮类化合物的极性更为接近，因而取得较大的得率，初步确定杏鲍菇黄酮提取的乙醇体积分数为70%。

液料比对杏鲍菇黄酮提取的影响见图2。在固定乙醇体积分数70%、微波时间4 min、微波功率 600 W 的条件下，液料比分别取 20、30、40、50、60 mL/g进行试验，当液料比为20～30 mL/g时，杏鲍菇黄酮的得率逐渐增高，在液料比为30 mL/g时得率达到最大值。液料比越大，扩散达到平衡时残留在组织内部的黄酮类化合物的量越小，因而表现出黄酮类化合物的得率越高。进一步增大液料比，杏鲍菇黄酮的得率反而略有下降。可能是液料比过大，影响了物料对微波能量的吸收，另外液料比越大加大了其他杂质的溶出，从而影响黄酮的提取。综合各方面考虑，初步确定液料比为30 mL/g。

微波功率对杏鲍菇黄酮提取的影响见图3。在固定乙醇体积分数70%、液料比40 mL/g、微波时间4 min的条件下，微波功率分别取400、500、600、700、800 W 进行试验，在 400 W 到 600 W 之间，杏鲍菇黄酮的得率随着功率的增加而升高，在600 W达到最大值，而后功率继续增大，黄酮实际得率反而降低。可能是由于功率过大，反应过于剧烈导致黄酮类化合物遭到破坏，因而表现出杏鲍菇黄酮得率骤然降低。综合各方面考虑，初步确定微波功率为600 W。

微波时间对杏鲍菇黄酮提取的影响见图4。在固定乙醇体积分数70%、液料比40 mL/g、微波功率600 W 的条件下，提取时间分别取 2、3、4、5、6 min进行试验，在2 min到4 min时黄酮得率随时间的增加而升高，在提取时间为4 min时黄酮得率达到最大值。时间过长，导致其他杂质溶解增加，并有少量的黄酮类化合物被破坏，杏鲍菇黄酮实际得率略有降低。在超过5 min后，大量的黄酮类化合物被破坏，导致杏鲍菇黄酮的得率迅速下降。因而，初步确定最佳时间为4 min。

2.2 正交试验正交试验设计及结果见表2。将表2中的数据进行极差分析，结果见表3。由表3可得，极差B＞A＞D＞C，杏鲍菇黄酮得率受到各因素的影响，液料比（B）对杏鲍菇黄酮得率影响最为显著，其次是乙醇体积分数（A），再次是微波时间（D），最后是微波功率（C）。表 3中，乙醇体积分数 K2＞K1＞K3＞K4，选择 A2为最优水平；液料比 K2＞K1＞K4＞K4，选择 B2为最优水平；微波功率 K3＞K2＞K4＞K1，选择C3为最优水平；微波处理时间K3＞K2＞ K1＞K4，选择 D3为最优水平，最优水平组合为A2B2C3D3。

表 2 L16（44）正交试验设计及结果

表3 极差分析结果

通过对试验结果的分析，可得微波提取杏鲍菇黄酮的提取工艺：乙醇体积分数为70%，液料比为30 mL/g，微波功率为600 W，微波时间为4 min。在此条件下进行3次平行试验，杏鲍菇黄酮得率分别为 2.59%、2.63%、2.57%，平均值为2.60%。杏鲍菇黄酮得率高、试验重现性好，说明正交试验得到的杏鲍菇黄酮提取工艺可行。