复合酶辅助高压法提取金针菇黄酮的纯化及活性测定

王广慧，谭吉丽，杜艳超，杨静怡，尚雅楠，任丽娜

（绥化学院食品与制药工程学院，黑龙江绥化 152061）

金针菇（FLammuLina veLutipes（Fr.）Sing）属于典型的木腐生菌类，口感香脆滑嫩、味道鲜美，而且含有多种生物活性物质如多糖、黄酮类化合物和其他免疫调节蛋白等，其中金针菇黄酮在抗氧化、抗肿瘤、抗诱变和改善记忆等方面具有明显功效（谭一罗等，2018），可开发为人及动物的保健食品。大孔吸附树脂因其具有理化性质稳定，不溶于强酸、强碱和有机溶剂中，对有机物选择性好，不受无机盐等离子和低分子化合物影响，节省费用等诸多优点，常被用于天然产物中有效成分的分离及纯化，但目前对大孔树脂纯化金针菇黄酮的研究报道较少。王广慧（2016）对复合酶辅助高压法提取金针菇黄酮的工艺条件进行了优化研究，本文将在此基础上继续探讨利用此法提取的金针菇黄酮经X-5型大孔树脂纯化后的抑菌性及抗氧化性问题，并对X-5型大孔树脂纯化金针菇黄酮的最佳工艺条件进行优化，以期能为金针菇黄酮的开发利用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 金针菇、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌 （Staphylococcus aureus）、沙门氏菌（salmonella enteritidis），由绥化学院微生物实验室提供；X-5型大孔吸附树脂，购自郑州勤实科技有限公司；亚硝酸钠、硝酸铝、乙醇、氢氧化钠等化学试剂均为国产分析纯，购自天津市博迪化工有限公司；木瓜蛋白酶、纤维素酶，购自北京奥博星生物科技有限责任公司。

1.2 主要仪器 HL-2型恒流泵，上海青浦沪西仪器厂；752型紫外-可见分光光度计，上海菁华科技仪器有限公司；TGL-20bR型冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂；PHS-25酸度计，上海伟业仪器厂；YXQ-LS-75SⅡ型立式压力蒸汽灭菌器，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；FW100型高速万能粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司；普通玻璃层析柱（16 mm×240 mm），上海青浦沪西仪器厂；牛津杯（内径6 mm），上海鲁硕实业有限公司；ZD-85型气浴恒温振荡器，江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 黄酮含量的测定 采用硝酸铝-亚硝酸钠法测定金针菇中黄酮的含量。标准曲线的绘制及线性回归方程的获得参见王广慧（2016）报道的方法。

1.3.2 复合酶辅助高压法提取金针菇黄酮 将金针菇干品用高速万能粉碎机粉碎，过80目筛。称取金针菇干粉，放入锥形瓶中，按照 1：35（g/mL）的料液比加入pH为6的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液和样品量1.00%的复合酶 （木瓜蛋白酶和纤维素酶按质量比1：1混合）。将锥形瓶放入50℃恒温水浴锅中酶解80 min。然后在115℃下进行高压热水浸提40 min。提取后以3500 r/min离心处理10 min，将上清液蒸发浓缩后加入3倍体积浓度为95%的乙醇，于4℃下醇沉12 h，将多糖等杂质离心除去，留上清液备用（王广慧，2016）。

1.3.3 X-5型大孔吸附树脂的预处理 称取X-5型大孔树脂放于锥形瓶中，加入体积浓度为95%的乙醇浸泡24 h后，先用95%乙醇洗至流出液清亮、无浑浊，再用蒸馏水洗至无醇味。然后分别用酸碱处理，即以5%（g/g）的 HCl溶液浸泡 4 h，蒸馏水洗至中性，再用 4%（g/g）的NaOH溶液浸泡4 h，蒸馏水洗至中性，备用。按如下公式计算大孔树脂的吸附率和解析率：

式中：C1、C2、C3分别为上样液黄酮质量浓度、饱和时流出液黄酮质量浓度、洗脱液黄酮质量浓度，mg/mL；V1、V2、V3分别表示饱和时上样液消耗的体积、饱和时流出液体积、洗脱液体积，mL。

1.3.4 X-5型大孔吸附树脂纯化金针菇黄酮工艺的优化 将处理后的树脂装入层析柱中，装柱高度为12 cm。先以树脂对金针菇黄酮的饱和吸附率为评价指标，分别探讨样品液pH、样品液浓度、样品液流速对吸附率的影响，然后再以黄酮解吸率为评价指标，分别考察洗脱液浓度、洗脱速率、洗脱剂用量对解析率的影响（张星等，2017；吴海霞等，2013；王国军等，2013）。

1.3.5 纯化前后金针菇黄酮纯度的对比 在最佳条件下进行吸附和洗脱，对比吸附前的黄酮纯度和洗脱后的黄酮纯度，即通过计算黄酮在解析液及样品液烘干后物质中所占的比例，得到纯化倍数。做平行试验3次。

1.3.6 纯化后金针菇黄酮的抑菌能力检测 采用抑菌圈法测定纯化后金针菇黄酮对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、沙门氏菌4种常见菌种的抗菌活性（曹培杰等，2019；许伟等，2010）。

1.3.6.1 菌悬液的制备 将活化后的菌种放置在37℃恒温振荡器中，以转速120 r/min连续振荡培养约24 h。当菌悬液在波长600 nm处OD值为0.1时取出备用。此时菌体浓度约为106～107菌落形成单位（cfu/mL）。

1.3.6.2 抑菌试验 在LB培养基平板上加入各菌悬液0.1 mL，用涂布棒涂布均匀，插入牛津杯。将0.1 mL不同质量浓度（mg/mL）经生理盐水稀释的金针菇黄酮溶液加入杯中，以生理盐水作为对照，置于37℃的培养箱中培养24 h后观察统计抑菌圈大小，并评价其抑菌效果。所有试验均设3组平行。

1.3.7 金针菇黄酮的抗氧化性研究 根据杨文建等（2017）和弓威等（2015）的方法进行金针菇黄酮的抗氧化研究。

1.3.7.1 对DPPH·清除能力的测定 在具塞试管中加入浓度为1.0×10-4mol/L的DPPH溶液3.5 mL和无水乙醇0.5 mL，闭光静置30 min，测定其在517 nm下吸光度A0；以0.5 mL样品液代替0.5 mL无水乙醇，其余同上，测出吸光度A1；取 3.5 mL无水乙醇与0.5 mL样品液，相同波长下测得吸光度A2。以3.5 mL无水乙醇和0.5 mL蒸馏水的混合液作为空白对照。平行测定3次，取平均值。同时以Vc为对照。

1.3.7.2 对O2-·清除能力的测定 向试管中加入2.8 mL pH 8.2的Tris-HCl缓冲液 （50 mmol/L)及0.1 mL不同浓度的黄酮提取液，放入25℃恒温水浴锅中，保温10 min，加入0.1 mL同样条件下预温的60 mmol/L邻苯三酚 （以60 mmol/L盐酸配制)，立即摇匀，倒入比色杯中，在420 nm处每隔0.5 min测一次吸光值，此吸光值记为A1。

用0.1 mL同样条件下预温的HCl溶液（60 mmol/L）代替邻苯三酚，其余步骤同上，测得吸光值A2；保留邻苯三酚，但用0.1 mL蒸馏水替代黄酮提取液，其余操作同上，测得吸光值A0。平行测定3次，取平均值。同时以Vc作为对照。

1.3.7.3 对OH·清除能力的测定 在试管中加入1.0 mL不同浓度的黄酮提取液，然后依次加入2.00 mL的 1.8 mmoL/mL FeS04溶液、1.5 mL的1.8 mmoL/mL水杨酸-乙醇、0.10 mL质量分数为0.03%的H2O2溶液，振荡混合，放入37℃恒温水浴锅中保温30 min，然后在510 nm下测定吸光度值 A1；用 0.10 mL蒸馏水代替 H2O2，重复上述操作，测得吸光度值A2；保留过氧化氢，但用蒸馏水代替黄酮提取液，重复上述操作，测得吸光值A0。以Vc作为对照。

1.3.7.4 对ABTS·清除能力的测定 精密称取ABTS 40.00 mg，依次加入10 mL蒸馏水，8.00 mL的1.0 mg/mL过硫酸钾，在室温避光条件下静置16 h，然后转移到250 mL容量瓶中，加32 mL蒸馏水，用无水乙醇定容至刻度，放置10 h备用。

在5只试管中依次加入0.5 mL不同浓度的黄酮提取液、1.5 mL 95%乙醇、2 mL配好的ABTS溶液，混合，静置30 min，在734 nm波长下测出吸光度值A1；用2 mL蒸馏水代替ABTS溶液，其他步骤同上，测得吸光度A2；保留ABTS溶液，但以95%乙醇代替黄酮提取液，其他步骤同上，测出吸光度值A0。同时以Vc作为对照。

2 结果与分析

2.1 线性回归方程 按照王广慧（2016）所述方法绘制标准曲线，得到线性回归方程为y=0.0949x+0.0024，R2=0.9992，其中 y 为吸光度值，x为芦丁浓度（mg/mL）。

2.2 X-5型大孔树脂纯化金针菇黄酮工艺的优化

2.2.1 样品液pH对饱和吸附率的影响 用5%盐酸溶液和2%的NaOH溶液调节样品液pH，分别设定为 4、5、6、7、8，上样流速为 0.35 mL/min，上样浓度为1.2 mg/mL，进行吸附试验并计算饱和吸附率（即当流出液的浓度达到初始浓度的1/10时，即可认为树脂已吸附饱和）。每个样品做三组平行试验，取平均值，试验结果见图1。

由图1可知，样品液pH太大和太小都不利于黄酮的吸附，原因可能是在弱酸状态下，黄酮类化合物以分子形式存在，容易被大孔树脂吸附，但酸性较强时，黄酮分子中的氧原子易形成盐而带上正电荷，不易被吸附；在偏碱性的状态下，黄酮分子羟基中的氢易解离，所以不容易被大孔树脂吸附。因此选择pH 5作为X-5大孔吸附树脂吸附金针菇黄酮的最佳pH。

2.2.2 样品液浓度对饱和吸附率的影响 调节样品液pH为5，设定样品液浓度分别为0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mg/mL， 上样流速为 0.35 mL/min，进行吸附试验并计算饱和吸附率。试验结果见图2。

由图2可知，当样品液浓度为1.4 mg/mL时，金针菇黄酮的吸附率最大，原因可能是样品液浓度太大，超过了树脂吸附的极限，黄酮就会过早流出，不易被吸附，导致吸附率降低；样品液浓度太小，不足以被大孔树脂吸附。因此选择1.4 mg/mL浓度作为X-5大孔吸附树脂吸附金针菇黄酮的最适浓度。

2.2.3 样品液流速对饱和吸附率的影响 在样品液浓度为1.4 mg/mL，pH为5的条件下，设定样品液流速分别为 0.20、0.35、0.5、0.65、0.80 mL/min，进行吸附试验并计算饱和吸附率。试验结果见图3。

由图3可知，样品液流速为0.2 mL/min时吸附率最高，原因可能是流速较慢时提取液与树脂接触的时间较长，有利于黄酮类物质扩散到树脂内部，从而提高了吸附率。

2.2.4 洗脱剂浓度对解析率的影响 在最佳条件下吸附饱和的树脂用蒸馏水清洗至无色，然后用乙醇洗脱。乙醇体积分数分别为40%、50%、60%、70%、80%，洗脱流速为2 mL/min，乙醇用量为50 mL，计算总黄酮解析率。试验结果见图4。

由图4可知，当洗脱剂体积分数为70%时，洗脱效果最好，原因可能是由于70%乙醇溶液与黄酮的极性最接近。根据“相似者相溶”的原理，此乙醇浓度下最有利于黄酮的洗脱。

2.2.5 洗脱剂流速对解析率的影响 采用70%乙醇溶液50 mL进行洗脱，设定洗脱剂流速分别为 1、2、3、4、5 mL/min，计算总黄酮解析率。 试验结果见图5。

由图5可知，洗脱速率越慢解析率越高，洗脱速率太快不宜于金针菇黄酮的洗脱，原因可能是流速越慢洗脱剂与树脂的接触越充分，洗脱的也更彻底，因此选择1 mL/min为金针菇黄酮的最佳洗脱速率。

2.2.6 洗脱剂用量对解析率的影响 采用70%乙醇溶液以1 mL/min的速率进行洗脱，设定洗脱剂用量为 10、20、30、40、50、60 mL，计算总黄酮解析率。试验结果见图6。

由图6可知，在洗脱剂用量为60 mL时，树脂上吸附的黄酮类化合物完全被洗出，因此选洗脱液的最佳用量为60 mL。

2.3 纯化前后金针菇黄酮纯度的对比 由表1可知，三组平行试验中纯化后金针菇黄酮的纯度平均是纯化前的1.83倍，可见用此工艺条件纯化金针菇黄酮效果较好。

表1 纯化前和纯化后的黄酮纯度

2.4 纯化后金针菇黄酮的抑菌性研究结果 由表2可知，在测试浓度范围内，几个菌种的培养基上均有抑菌圈形成，可见金针菇黄酮对4种菌体均有不同程度的抑制作用，其抑菌效果随着金针菇黄酮浓度的增大而增强。抑菌程度大小的顺序为：大肠杆菌＞沙门氏菌＞金黄色葡萄球菌＞枯草芽孢杆菌。

表2 黄酮浓度对菌种抑菌圈直径的影响

2.5 金针菇黄酮的抗氧化性研究结果

2.5.1 对DPPH·清除能力的测定结果 由图7可知，当浓度为0.25～0.85 mg/mL时，金针菇黄酮和Vc对DPPH·的清除率都随着浓度的加大而升高，但在同浓度下金针菇黄酮的清除率明显低于Vc。

2.5.2 对O2-·清除能力的测定结果 由表3可知，在一定浓度下，随着时间的延长，金针菇黄酮和VC对O2-·的清除率都呈下降趋势。当浓度为0.25～0.85 mg/mL时，二者对O2-·的清除率都随着浓度的加大而提高，但金针菇黄酮的清除率总体上来看比相同浓度时的Vc低。

2.5.3 对OH·清除能力的测定结果 由图8可知，当浓度为0.25～0.85 mg/mL时，金针菇黄酮和VC对OH·的清除率都随浓度的增加而增加，但在同浓度下，金针菇黄酮对OH·的清除能力比Vc弱。

2.5.4 对ABTS·清除能力的测定结果 由图9可知，当浓度为0.25～0.85 mg/mL时，金针菇黄酮和Vc对ABTS·的清除率均随二者浓度的增加而升高，但当浓度相同时，前者的清除率明显弱于后者。

3 结论

本文主要是对采用复合酶辅助高压法提取的金针菇黄酮经X-5型大孔树脂纯化后的抑菌和抗氧化能力进行检测，同时对X-5型大孔树脂纯化金针菇黄酮的条件进行了优化研究。根据研究结果得出如下结论：

表3 黄酮与Vc清除超氧阴离子自由基能力比较

3.1 X-5型大孔树脂可以作为纯化金针菇黄酮的介质，其最佳吸附条件为：浓度1.4 mg/mL，pH 5，上样流速为0.2 mL/min；最佳洗脱条件为：浓度70%的乙醇60 mL，洗脱速率1 mL/min。在此条件下得到的黄酮纯度是纯化前的1.83倍。

3.2 抑菌试验表明：金针菇黄酮对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌均有不同程度的抑制作用，其抑菌效果随着金针菇黄酮浓度的增大而增强。抑菌程度大小的顺序为:大肠杆菌＞沙门氏菌＞金黄色葡萄球菌＞枯草芽孢杆菌。

3.3 抗氧化试验表明：Vc和金针菇黄酮溶液均具有抗氧化作用，金针菇黄酮和Vc溶液对DPPH自由基、羟基自由基、超氧阴离子自由基和ABTS自由基的清除能力均随着浓度的增加而增大；金针菇黄酮对这四种自由基的清除能力均要弱于Vc。

由以上研究结果可知，利用复合酶辅助高压法提取金针菇黄酮后采用X-5型大孔树脂进行纯化处理，此工艺流程可行。