微波协同酶法提取玫瑰花渣多糖工艺优化

姜曼，张伟

（济宁职业技术学院生物与化学工程系，山东济宁 272037）

玫瑰性甘、微苦，含有丰富的营养成分，有良好的食用、保健及药用价值。我国玫瑰种植广泛且目前绝大多数用于玫瑰精油的提取，但精油得率非常低（约0.03%）[1-2]，同时会产生大量的副产物如玫瑰花渣。研究发现，玫瑰花渣中含有大量的功能性有机物，如多糖、黄酮、酚类、维生素、β-胡萝卜素等[3]，其中多糖含量高达30%[4]。作为一种植物多糖，玫瑰花渣多糖具有增强机体免疫、抗氧化、降血脂、抗肿瘤等生物活性功能[5-8]，可将其提取、分离、纯化，开发成新型原料功能性食品，迎合了目前提倡营养膳食的大潮流，也符合现代人的消费理念，潜力巨大。精油生产厂家通常会将玫瑰花渣作为垃圾直接丢弃，造成资源严重浪费，同时污染环境。充分利用副产物，“变废为宝”，是解决这些问题、促进玫瑰产业的发展的有效措施。

目前，玫瑰花渣多糖的提取方法主要有热水浸提法、酸碱提取法、微波辅助提取法、超声波法、酶法提取等。水提法是提取植物多糖的传统方法，但提取率低。马猛华等[9]采用热水浸提法提取玫瑰花渣中的多糖，时间5 h，提取温度100 ℃，得率0.6%。张曰辉等[10]采用纤维素酶法提取玫瑰花渣多糖，酶反应时间150 min，可溶性多糖提取率为4.49%，提取时间较长。陈东明[11]利用超声波提取玫瑰花渣多糖，超声温度20 ℃，提取时间3 h，多糖提取量为4.126 mg/g。由此可见，采用单一方法提取玫瑰花渣多糖存在提取率低、时间长的问题，本文采用微波协同酶法提取玫瑰花渣多糖，这在文献中鲜见报道。以玫瑰花渣为原料，通过单因素试验研究纤维素酶酶解温度、纤维素酶酶解pH、微波处理时间、微波功率、料液比对玫瑰花渣多糖得率的影响，在此基础上，采用正交试验对工艺条件进行优化，确定微波协同酶法提取玫瑰花渣多糖的最佳工艺条件，为玫瑰花渣多糖的提取和利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

玫瑰花渣：提取玫瑰精油产生的副产物浸渣（山东津华生物技术有限公司提供），干燥后置于4 ℃冰箱，备用。纤维素酶：40 000 U/g，购自河北拓海生物科技。葡萄糖、浓硫酸、苯酚、丙酮、无水乙醇等试剂，均为分析纯。

1.2 仪器与设备

TU-1901 紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；FA2004 电子天平，上海精密科学仪器有限公司；HHS-2 水浴锅，上海天平仪器厂；KH30R-II 台式通用高速冷冻离心机，湖南凯达科学仪器有限公司；格兰仕P70F23P-G5 微波炉，佛山顺德格兰仕电器厂；DHG-9035 电热恒温鼓风干燥箱，华北实验仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 玫瑰花渣多糖的提取

将玫瑰花渣原料粉粹后过筛，称取5 g 样品，按料液比1:30（g/mL）加入去离子水，加入4.2%纤维素酶进行酶解，并以微波辅助提取。将浸提液在8 000 r/min 条件下离心10 min 后脱蛋白。重复浸提2 次，合并3 次上清液。将上清液减压浓缩，用4 倍体积的无水乙醇沉淀多糖，定容至一定体积，得到玫瑰花渣粗多糖溶液。

1.3.2 单因素试验

基于前期试验的基础，选择酶解温度（35、40、45、50、55、60 ℃）、酶解pH（3.8、4.0、4.2、4.4、4.6、4.8）、微波处理时间（2、3、4、5、6 min）、微波功率（200、350、500、650、800 W）、料液比（1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35，g/mL）分别进行单因素试验。

1.3.3 正交试验

根据单因素的试验结果，选择酶解温度、微波功率、微波处理时间，以玫瑰花渣多糖含量为考察指标，设计三因素三水平的正交试验，并对提取工艺条件进行优化。试验设计见表1。

表1 试验因素水平表Table1 Levels and factors of experiment

1.4 玫瑰花渣粗多糖含量的测定

采用苯酚-硫酸法测定多糖含量[12]。精确称取葡萄糖100 mg，定容至1 000 mL，配制葡萄糖标准溶液。分别取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL 标准溶液至比色管中，加入1 mL、5%苯酚溶液、5 mL 浓硫酸，混匀，静置15 min，于490 nm 波长处测吸光度。粗多糖得率计算公式见式（1）。

1.5 数据处理

利用Excel、SPSS 进行正交试验设计及数据处理。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的制作

选取不同浓度梯度的葡萄糖标准溶液，于波长490 nm处测定吸光度。以葡萄糖标准溶液浓度为自变量x，吸光度值为变量y，得到标准曲线回归方程y＝0.132x+0.469 1，相关系数R2＝0.999 3，其线性关系良好。

2.2 单因素试验

2.2.1 酶解温度对多糖得率的影响

由图1 可知，随着纤维素酶酶解温度的升高，多糖得率先升高后降低，符合酶的一般特性。在35～50 ℃温度范围内，因为有酶的参与，反应速度明显加快，多糖得率增加；随着温度的继续增加，多糖得率呈现下降的趋势，且下降幅度较大。这是由于纤维素酶此时活性降低甚至已经失活的缘故。45～50 ℃温度区间范围内多糖得率较高。综合考虑，酶解温度选择40、45、50 ℃三个水平进行的正交试验。

2.2.2 酶解pH 对多糖得率的影响

由图2 可知，纤维素酶的酶解pH 变化规律与酶解温度一致，先升高后降低。pH 为4.4 时，多糖得率最高；之后pH 升高，纤维素酶活性下降。因此，最佳酶解pH 确定为4.4。

2.2.3 微波功率对多糖得率的影响

图3 显示了微波功率对多糖得率的影响，由图可知，玫瑰花渣多糖的得率与微波功率基本呈正相关。因为微波是一种穿透力极强的电磁波，微波处理相当于加热，能使胞内成分溶出。当微波功率为650 W 时，玫瑰花渣多糖得率最高，为6.78%。当功率增加到800 W 时，多糖得率稍有下降，不过下降幅度不大。可能由于过高功率升温使多糖物质结构改变所致。综合考虑安全性和能耗、成本问题，微波功率选择350、500、650 W 三个水平进行正交试验。

2.2.4 微波时间对多糖得率的影响

图4 显示了微波处理时间对多糖得率的影响，由图可知，随着微波处理时间的增加，多糖得率呈现先增加后减少的趋势。当微波时间小于4 min 时，多糖得率逐渐升高，这可能是由于微波立体穿透的作用方式加快了多糖物质对基体的溶解。但试验还发现时间大于4 min 后多糖得率逐渐降低。因此，微波处理时间选择4 min。

2.2.5 料液比对多糖得率的影响

图5 显示了料液比在微波条件下对多糖得率的影响。由图可知，随着料液比的变小，多糖得率先增加后趋于平稳。由于传质速度越来越快，有更多的玫瑰花渣多糖溶解到溶剂中。综合考虑，料液比选择1:30。

2.3 微波协同酶法提取的正交试验

根据前期研究结果及单因素试验，选择酶解温度、微波功率、微波处理时间这三个对多糖得率影响较大的因素进行正交试验，结果见表2。

表2 正交试验结果Table 2 Results of orthogonal experiment

由表2 可知，3 个因素对多糖得率影响的主次顺序为A＞C＞B，即酶解温度＞微波功率＞微波处理时间。正交设计得到的最优组合为A3B1C3，即酶解温度50 ℃，微波功率650 W，微波处理时间4 min。此结果与正交试验方案中第7 组试验条件一致。因此，我们选出的最优方案是合理的。

3 结论

本试验通过单因素试验、正交试验优化得到微波协同酶法提取玫瑰花渣多糖的最佳提取工艺条件，即纤维素酶加酶量4.2%，酶解温度50 ℃，酶解pH 值4.4，微波功率650 W，微波处理时间4 min，料液比1:30，此时多糖得率为6.53%。与传统热水浸提法、微波法、超声法、酶法等提取方法相比，该方法的提取条件温和，多糖得率较高。后续研究可考虑采用两种及以上复合酶（双酶法）的形式，亦或是超声波与酶法联用提取玫瑰花渣多糖，可做进一步的研究。