谷氨酸棒杆菌对砷的耐受性及去除效果

杨新瑶, 闫馨予, 唐 章, 陈芳敏

(沈阳大学 a. 区域污染环境生态修复教育部重点实验室, b. 城市有害生物治理辽宁省重点实验室, 辽宁 沈阳 110044)

砷(As)是一种自然界中普遍存在的剧毒类金属元素[1-2],它主要产生于地质作用[3],但是近年来由于人类活动的干预,如化石燃料的燃烧、含砷矿物的开采、冶金废物的排放,以及不适当的农业或医疗用途等加剧了砷对环境的污染[4-6].砷与其他重金属一样,一旦进入环境后长期存在,且会四处扩散,对人类、动物和其他有机体造成有害的影响.当前,土壤、水及空气中的砷污染已成为一个全球性的环境问题,受到了国内外学者的广泛关注,其中水环境中砷的污染问题尤为严重.世界卫生组织(WHO)和美国环境保护署(USEPA)规定饮用水中As质量浓度不得高于10 μg·L-1[6-7],但许多国家都达不到规定标准,一些污染较为严重的国家如印度、孟加拉国,其局部地下水砷质量浓度可高达3 200 μg·L-1,远超出规定的限值[8].据不完全统计,世界上有70多个国家、超过230个地区均存在高砷水污染现象[9],且有超过1.5亿人遭受砷污染水体的威胁,我国也有230多万人受砷污染地下水的影响[10].长期接触高砷污染水体会引发一系列人类疾病[11-12],如皮肤癌、高血压、心血管疾病等,甚至会造成致命威胁,因此解决水体砷污染问题十分迫切.

砷的毒性与它的存在形态有关,单质砷对人体和生物体无毒[4],无机砷比有机砷毒性大,其中,无机亚砷酸盐(As(Ⅲ))和砷酸盐(As(Ⅴ))的毒性最强,同时也是水环境最主要的存在形式[11-12].水体中的砷虽不能像有机污染物一样被降解成无害的化学物质[13],但它可以被固定或转化为毒性较小的形式[1].目前,常用的高砷水修复技术主要有吸附法、混凝沉淀法、氧化法、离子交换法、膜分离法、植物法和微生物法等[14].由于传统的物化处理方法存在着能耗高、产生二次污染的特点,微生物法修复砷因其高效、环保且成本低等优势而具有较大的应用前景.

微生物法修复砷是指通过具有耐砷、抗砷及转化砷价态功能的微生物对砷的吸附、积累和转化作用,来降低或消除砷的毒性[13,15-16].有研究表明,一些微生物在高砷环境中可以生存,它们在对砷产生抗性的同时,也会进化出各种耐砷机制,在砷的生物地球化学循环过程中发挥重要作用[17].例如,Katsoyiannis等[18]发现球衣细菌、纤维菌和铁细菌等一些地下水中的土著微生物,可以把溶液中的As(Ⅲ)氧化为As(Ⅴ),并通过与Fe3+的共沉淀作用来去除水体中的砷.Prasad等[19]发现一种红球菌(Rhodococcussp.WB-12)可以对砷进行吸附,当pH值为7.0时,其对As(Ⅲ)的最大吸附量可达77.3 mg·g-1.

而谷氨酸棒杆菌(CorynebacteriumglutamicumATCC 13032)作为一种工程模式菌用于工业生产氨基酸和核苷酸,已有研究报道其可在含亚砷酸盐和砷酸盐的培养基(富营养环境)中生长[1,20],表明该菌具备砷修复潜力.但该细菌在水环境(即贫营养环境)中对砷的修复应用尚未见报道,本文以谷氨酸棒杆菌(CorynebacteriumglutamicumATCC 13032)为研究对象,探索了其在培养基中对不同质量浓度砷(As(Ⅴ))的耐受性及在含砷水中(即贫营养环境中)对砷的去除效果,旨在为微生物修复砷技术提供数据参考.

1 试 验

1.1 仪器与材料

台式全温振荡器(TQZ-31,精宏实验设备有限公司,上海),pH计(PB-10,Sartorius,德国),高压灭菌锅(SX-500,TOMY,日本),紫外可见分光光度计UV(U-2910,Hitachi,日本),台式高速离心机(H/T16MM,赫西仪器装备有限公司,湖南),电感耦合等离子体质谱仪ICP-MS(7700ce,Agilent,美国);牛肉膏(BR,Solarbio,北京),蛋白胨(BR,Solarbio,北京),氯化钠(AR,恒兴试剂,天津),谷氨酸棒杆菌(CorynebacteriumglutamicumATCC 13032,工程模式菌, BNCC 185926,北纳生物,北京),砷酸钠NaAsO3(AR,艾科试剂,成都),亚砷酸钠NaAsO2(AR,艾科试剂,成都).

1.2 谷氨酸棒杆菌对砷(As(V))的耐受性

液体培养基制备:在250 mL超纯水中加入7.5 g蛋白胨、0.75 g牛肉膏和1.25 g氯化钠,使用pH计通过氢氧化钠调整pH值为7.0后,在高压灭菌锅中(121 ℃)灭菌20 min.

将谷氨酸棒杆菌接种在液体培养基中扩大培养,在37 ℃恒温振荡器中以120 r·min-1转速培养2 h,用紫外可见分光光度计(UV)测试OD600值表示细菌的浓度,此时细菌OD600值为0.25,设为此试验中细菌的初始浓度.将含培养基的菌液分装在5个锥形瓶中(每瓶30 mL),在锥形瓶中加入NaAsO3(As(Ⅴ))溶液使砷质量浓度分别为0、0.1、0.5、1.0、10.0 mg·L-1,再继续进行恒温振荡培养,分别在7 h和24 h后用紫外可见分光光度计(UV)测各锥形瓶中细菌浓度,计算细菌的增长率和相对增长率,增长率计算方法如式(1)所示,相对增长率计算方法如式(2)所示,从而比较不同质量浓度的砷(As(V))对细菌生长状态的影响.

1.3 谷氨酸棒杆菌对砷的去除

将谷氨酸棒杆菌接种在液体培养基中,在37 ℃恒温摇床中以120 r·min-1转速培养10 h,细菌OD600=1.05(一般认为细菌OD600值为1左右时细菌处于稳定期或对数生长后期,此时细菌数量较稳定),然后取10 mL菌液在5 000 r·min-1下离心5 min,分离得到细菌沉淀,在细菌沉淀中分别加入10 mL质量浓度为1 mg·L-1的NaAsO2(As(Ⅲ))溶液和NaAsO3(As(Ⅴ))溶液,2种砷溶液的离子强度均用NaCl溶液调至10 mmol·kg-1,混匀后在37 ℃全温振荡器中培养1 h.对培养后的菌液进行离心分离(5 000 r·min-1,5 min),对离心后上清液中砷质量浓度采用电感耦合等离子体质谱仪ICP-MS进行测试,记为未被菌摄入的砷;在离心后得到的细菌沉淀中加入超纯水后超声3 min,以洗下可能吸附在细菌表面的砷,然后再一次离心分离,测离心的上清液中砷质量浓度,记为吸附在细菌表面的砷,吸附率计算方法如式(3)所示.取细菌沉淀测砷质量浓度,记为摄入细菌体内的砷,摄取率计算方法如式(4)所示.通过分离测试与细菌共同作用1 h 后的溶液中砷的质量浓度,以砷的去除率来评价细菌对砷的去除效果,去除率计算方法如式(5)所示.

2 结果与讨论

表1为培养基中不同质量浓度砷(As(Ⅴ))溶液中谷氨酸棒杆菌生长状态参数,图1为培养基中不同质量浓度砷(As(Ⅴ))溶液中谷氨酸棒杆菌相对增长率随时间的变化.从表1可以看出,加入砷后培养7 h、24 h后,细菌OD600检测发现细菌均能生长.对照表1和图1,可知加入质量浓度为10.0 mg·L-1的As(Ⅴ)溶液中细菌浓度相对不加砷的对照组中7 h相对增长率有明显减少(7 h相对增长率为-28.80%),表示此质量浓度下的As(Ⅴ)在7 h内会对细菌生长起到明显的抑制作用;而加入As(Ⅴ)质量浓度为0.5和1.0 mg·L-1对细菌生长有一定的促进作用,均表现出7 h相对增长率为正值(5.7%、4.3%);加入As(Ⅴ)质量浓度为0.1 mg·L-1溶液则对细菌生长影响很小(7 h相对增长率为-0.2%).加砷培养24 h后,发现加入As(Ⅴ)质量浓度为10.0 mg·L-1溶液对细菌生长起到促进作用(24 h相对增长率为4.8%),加入As(Ⅴ)质量浓度为0.5和1.0 mg·L-1溶液对细菌生长仍有一定的促进作用(24 h相对增长率分别为1.6%、7.0%),而加入As(Ⅴ)质量浓度为0.1 mg·L-1溶液对细菌生长影响依然很小(24 h相对增长率为0.1%).

表1 培养基中不同质量浓度砷(As(Ⅴ))溶液中谷氨酸棒杆菌生长状态参数

图1培养基中不同质量浓度砷(As(Ⅴ))溶液中谷氨酸棒杆菌相对增长率随时间的变化

Fig.1VariationofrelativegrowthrateofCorynebacteriumglutamicumunderdifferentmassconcentrationsofarsenic(As(Ⅴ))inculturemediumwithtime

由此可见,加入0.1 mg·L-1As(Ⅴ)溶液对谷氨酸棒杆菌生长几乎没有影响,加入0.5、1.0 mg·L-1As(Ⅴ)溶液对谷氨酸棒杆菌生长有一定的促进作用,这可能是由于砷作为一种类重金属元素有着与重金属元素类似的性质,低质量浓度下会促进细菌生长[21-22].加入10.0 mg·L-1As(Ⅴ)溶液在7 h对细菌生长有明显的抑制作用,而24 h后则有一定的促进生长的作用,这可能是由于在反应前期(7 h)高质量浓度砷会破坏细菌的结构,阻碍细菌的繁殖,而随着反应时间延长,细菌逐渐进化出抵抗重金属的机制,使得细菌适宜在高砷环境中生长,从而获得一定的促进生长作用,在另一方面,可能是由于反应器中有机质的营养物质有限,在反应进行到24 h后已经没有足够的营养物质供细菌继续生长,导致24 h后不同质量浓度As(Ⅴ)溶液中细菌OD600值均为2左右.

这一方面证实了谷氨酸棒杆菌在培养基中对砷有很高的耐受性,另一方面发现细菌生长的砷浓度效应,即加入0.5、1.0 mg·L-1的As(Ⅴ)溶液会促进细菌的生长,加入10.0 mg·L-1As(Ⅴ)溶液在反应前期会对细菌生长起抑制作用,但反应时间延长后则能在一定程度上促进细菌的生长.

表2为谷氨酸棒杆菌在含砷水(即贫营养环境)中对砷的去除效果.对比在细菌OD600值同为1.05的细菌中加入质量浓度均为1.0 mg·L-1的NaAsO2(As(Ⅲ))溶液和NaAsO3(As(Ⅴ))溶液,结果表明相同细菌浓度下,谷氨酸棒杆菌对2种不同价态的砷均有一定去除效果,细菌对As(Ⅴ)的摄入质量浓度为7.58 μg·L-1,高于As(Ⅲ)的2.78 μg·L-1,这表明OD600=1.05的细菌对As(Ⅴ)及As(Ⅲ)均有摄入能力.谷氨酸棒杆菌能摄入砷是由于砷与磷同为第VA族的元素,砷酸盐与磷酸盐结构类似,可通过磷酸盐转运蛋白进入细胞,会通过替换细胞磷酸盐而干扰正常的磷酸化过程,对细菌产生毒害作用[23];亚砷酸盐通过细菌的水甘油转运蛋白进入细胞,能通过结合蛋白质中半胱氨酸残基的巯基使其失活,从而对细菌产生毒害作用[20].与此同时,细菌表面还能吸附砷,主要通过细菌产生的胞外聚合物(EPS)等对砷产生络合作用[19],吸附质量浓度分别为33.00和35.02 μg·L-1.对比发现谷氨酸棒杆菌对As(Ⅴ)的摄入能力强于As(Ⅲ),这可能是由于As(Ⅲ)的生物毒性强于As(Ⅴ)[24]导致细菌对As(Ⅲ)的摄取更低,相同细菌浓度下的谷氨酸棒杆菌对2种价态的砷的去除率则相差很小,分别为4.06%和3.78%.

表2 谷氨酸棒杆菌在含砷水中(即贫营养环境)中对砷的去除效果

对比不同浓度的细菌对As(Ⅲ)的去除效果,发现低浓度细菌(OD600=0.35)对As(Ⅲ)的摄入量(34.83 μg·L-1)要远高于高浓度细菌(OD600=1.05)的摄入量(2.78 μg·L-1),这可能由于较低的OD600值代表细菌处于对数生长期,细菌活性相对更高,更早适应砷的毒性.细菌对As(Ⅲ)的吸附效果则相反,高浓度细菌其吸附量(35.02 μg·L-1)高于低浓度细菌吸附量(19.59 μg·L-1),这可能是由于低浓度的细菌数量相对较少,所提供的有效吸附面积小,同时,细菌还未生长至成熟状态,吸附能力也较差.总的去除效果表现为低浓度细菌对As(Ⅲ)的去除率更高(5.44%>3.78%).

因此, 细菌对砷去除效果与细菌浓度有关, 本试验数据是在贫营养环境中所得, 而相对营养丰富的环境下细菌的生长状态会更好, 细菌浓度会更大, 去除率会更高; 另一方面,细菌生长状态会影响其对砷的摄取, 因此可以考虑使用生长状态更好、细胞活性更高的细菌来提高砷的去除率.

3 结 论

1) 谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum,ATCC 13032)对砷有良好的耐受性.在营养丰富的培养基中,低质量浓度砷(As(Ⅴ))会一直促进细菌的生长,高质量浓度砷(As(Ⅴ))在反应开始阶段会抑制生长,而反应时间延长后高质量浓度砷(As(Ⅴ))对细菌生长也有促进作用.

2) 在贫营养的水环境中,细菌通过将As(Ⅲ)和As(Ⅴ)摄入体内及吸附在表面以达到去除砷的效果.

3) 在相同细菌浓度(OD600=1.05)下,谷氨酸棒杆菌对As(Ⅴ)的摄入强于As(Ⅲ);在不同细菌浓度(OD600=1.05)和(OD600=0.35)下,低细菌浓度(OD600=0.35)的谷氨酸棒杆菌对As(Ⅲ)的摄入远高于高细菌浓度(OD600=1.05)条件,低细菌浓度的谷氨酸棒杆菌对As(Ⅲ)的去除率也高于高细菌浓度条件.