青藏高原牦牛支原体血清抗体检测及流行趋势研究

王冬经，徐业芬，严明帅，索朗斯珠，赵霞玲，参木友，朱 勇，牛家强*

(1.西藏农牧学院 动物科学学院，西藏 林芝 860000；2.西藏农牧学院 西藏高原动物疫病研究自治区校重点实验室，西藏 林芝 860000；3.西藏农牧科学院草原研究所，西藏 拉萨 850000；4.西藏农牧科学院畜牧兽医研究所，西藏 拉萨 850000)

【研究意义】牦牛是我国青藏高原高寒缺氧地区的特色畜种和优势畜种，属于肉、乳、毛、使役兼用的品种，主要分布在我国西藏、青海、四川、甘肃、云南等地[1]。由于牦牛多生活在海拔较高的高山地带，气候寒冷多风，昼夜温差大等，牛呼吸性疾病成为影响我国牦牛产业持续健康发展的重要疾病。牛支原体(Mycoplasmabovis)可引发牛肺炎、乳房炎、生殖道炎、耳炎等多种疾病，给养牛业业造成了不可估量的损失[2]。【前人研究进展】据资料显示，牛支原体可感染奶牛、肉牛、牦牛、水牛，通常不感染人[3-4]。目前有关我国甘肃、青海、四川、西藏等地牦牛支原体感染的全面调查和系统性分析资料还未见报道。【本研究切入点】为了探明我国青藏高原牦牛支原体的感染状况及流行趋势，本文对我国牦牛数量最多、分布最广的西藏地区进行了牦牛支原体流行病学调查，结果发现，西藏牦牛支原体感染率竟已高达46.10 %(201/436)[5]，且呈现出逐年上升趋势。【拟解决的关键问题】对来自四川、甘肃、青海的牦牛群进行牛支原体血清抗体检测，初步研究目前牛支原体病在我国牦牛群中的流行情况，分析其流行趋势。

1 材料与方法

1.1 血清来源

从四川、甘肃、西藏、青海采集牦牛血液959 份(其中四川56 份；甘肃243 份；西藏436 份；青海224 份)。试验采用一次性使用静脉血样采集针和一次性使用真空采血管采集牦牛全血，血液采集后冷藏运输至实验室，4000 r/min，离心时间5 min，吸取上层的血清，分装后置于-20 ℃保存，检测前取出，置于室温下解冻。

1.2 主要试剂

牛支原体抗体ELISA检测试剂盒(批号为CK-D77383)购自上海酶联生物科技有限公司。

1.3 主要仪器

本试验所用一次性使用静脉血样采集针(购自山东省成武县医用制品厂)、一次性使用真空采血管(购自江苏宇力医疗器械有限公司)、恒温培养箱(购自上海博讯实业有限公司医疗设备厂)、自动酶标仪(购自深圳雷杜生命科学股份有限公司)、超纯水机(购自成都超纯科技有限公司)及微量移液器(购自赛伯乐(上海)仪器有限公司)均由西藏农牧学院西藏高原动物疫病研究自治区高校重点实验室提供。

1.4 ELISA检测

本研究所检血清样品均采用牛支原体抗体(MCP-Ab)ELISA检测试剂盒进行检测，试验操作严格按照试剂盒说明书要求进行。

1.5 结果判断

试验有效性判断：阳性对照孔OD值平均值≥1.00且阴性对照孔OD值平均值≤0.15。临界值计算：临界值=阴性对照孔平均值+0.15。阴性判断：样品OD值<临界值，则样品为阴性。阳性判断：样品OD值>临界值，则样品为阳性。

1.6 数据的统计与分析

采用SPSS21.0软件对不同采样地区牦牛支原体血清抗体阳性率进行显著性分析，P>0.05时，差异不显著性；P<0.05时差异显著；P<0.01时，差异极显著。

2 结果与分析

2.1 青藏高原牦牛支原体检测结果

由表1可得，四省(区)牦牛支原体抗体平均阳性率为48.70 %(467/959)：其中四川、甘肃、西藏、青海阳性率分别为64.29 %(36/56)、53.09 %(129/243)、46.10 %(201/436)、45.09 %(101/224)。

对不同省区牦牛支原体抗体检测结果进行差异分析，结果显示，四川地区牦牛支原体抗体阳性率与甘肃地区比较，差异不显著(P>0.05)，与青海和西藏比较，差异均显著(P<0.05)；甘肃、西藏、青海3地比较，牛支原体抗体阳性率差异均不显著(P>0.05)。

2.2 不同年龄牦牛血清抗体阳性率检测结果

由表2可知，四省区不同年龄牦牛支原体抗体阳性率分布如下：四川1岁以下为77.78 %；1～2岁为63.64 %；3～6岁为58.82 %；6岁以上为63.16 %；甘肃1岁以下为60.00 %；1～2岁为48.94 %；3～6岁为43.66 %；6岁以上为60.00 %；西藏1岁以下为52.78 %；1～2岁为44.58 %；3～6岁为43.41 %；6岁以上为46.05 %；青海1岁以下为51.35 %；1～2岁为41.86 %；3～6岁为46.97 %；6岁以上为42.31 %。4省区不同年龄牦牛支原体抗体平均阳性率分布如下：1岁以下为55.70 %；1～2岁为46.20 %；3～6岁为45.20 %；6岁以上为49.70 %。

对不同年龄牦牛支原体抗体检测结果进行差异分析表明，从不同省区来看，不同年龄段牦牛支原体抗体阳性率比较，差异均不显著(P>0.05)；从总体平均阳性率来看，1岁以下牦牛支原体抗体阳性率高于3～6岁，且差异显著(P<0.05)，其余差异不显著(P>0.05)。

表1 藏区各地牦牛支原体抗体阳性率检测结果及显著性分析

注：同列数据进行比较，含有相同字母表示差异不显著(P>0.05)，不含有相同字母表示差异显著(P<0.05)。

Note：Compared with the data in the same column, if there are the same letters, the difference is not significant (P> 0.05), otherwise the difference is significant.

2.3 不同性别牦牛血清抗体阳性率检测结果

由表3可知，四川省牦牛支原体抗体阳性率雄性和雌性分别为52.63 %、70.27 %；甘肃省雄性阳性率为40.45 %，雌性阳性率为60.39 %；西藏雄性阳性率为50.41 %，雌性阳性率为44.44 %；青海省雄性阳性率为43.30 %，雌性为46.46 %。四省区总体阳性率来看，雄性阳性率为45.71 %，雌性阳性率为50.24 %。

对不同性别牦牛支原体抗体检测结果进行差异分析表明，甘肃省雌性阳性率高于雄性，且差异显著(P<0.05)；四川、西藏、青海不同性别比较，其阳性率差异不显著(P>0.05)。从总体结果来看，四个省区雌性平均阳性率高于雄性，但差异不显著(P>0.05)。

3 讨 论

根据D. L. Grand 等的研究：应用血清学方法检测牛支原体血清抗体阳性率，并能够以此为依据评价牛支原体的感染[6]。我国青藏高原牦牛均未接种牛支原体疫苗，因此本次检测结果能够反应牦牛支原体感染状况。

表2 不同年龄牦牛血清抗体阳性率检测结果及显著性分析

注：同行数据进行比较，含有相同字母表示差异不显著(P>0.05)，不含有相同字母表示差异显著(P<0.05)。

Note: Compared with the data in the same column, if there are the same letters, the difference is not significant (P> 0.05), otherwise the difference is significant.

表3 不同性别牦牛血清抗体阳性率检测结果及显著性分析

注：同行数据进行比较，含有相同字母表示差异不显著(P>0.05)，不含有相同字母表示差异显著(P<0.05)。

Note: Compared with the data in the same column, if there are the same letters, the difference is not significant (P> 0.05), otherwise the difference is significant.

本次试验采用ELISA检测方法，对四川、甘肃、青海3省区牦牛支原体血清抗体进行检测，并按照不同年龄、不同性别进行统计分析，用卡方检验对牦牛支原体血清抗体阳性率进行显著性分析。经检测发现，四川、甘肃、西藏[5]、青海阳性率依次为64.29 %、53.09 %、46.10 %、45.09 %。四川阳性率与青海和西藏比较，差异均显著(P<0.05)，与甘肃地区比较，差异不显著(P>0.05)；甘肃、西藏、青海3地比较，阳性率差异均不显著(P>0.05)。由此可见，我国青藏高原牦牛感染牛支原体较为普遍，且以四川省较为严重，其次是甘肃省。

2012年，李坤[7]等人的研究结果表明，四川牦牛支原体血清抗体阳性率为47.41 %，2013年，其阳性率为55.25 %[8]。与本次检测结果(64.29 %)比较可知，2012年以来，四川牦牛支原体血清抗体阳性率呈现较快增长趋势。根据李坤[7-8]等人的研究，2012、2013年西藏牦牛支原体血清抗体阳性率依次为44.32 %、44.50 %；2017年，本人对来自西藏全区的 436 份牦牛血清进行检测，结果检出阳性血清201份，其阳性率为46.10 %[5]。由此看出，2012年以来，西藏地区牦牛对牛支原体存在持续感染状态，并且呈现缓慢上升趋势。2011年，魏廷虎[9]的检测结果表明青海省玉树县牦牛支原体血清抗体阳性率为25.39 %；本次检测结果表明，青海省阳性率为45.09 %，由此证明，2011年以来青海省牦牛支原体血清抗体阳性率呈现较快上升趋势。

从不同年龄段牦牛血清抗体阳性率检测结果来看，不同省区不同年龄段牦牛支原体抗体阳性率比较，差异均不显著(P>0.05)，但1岁以下牦牛抗体阳性率均高于其他年龄段；从总体平均阳性率来看，1岁以下牦牛支原体抗体阳性率高于3～6岁，且差异显著(P<0.05)。其原因可能是因为犊牛的抵抗力较弱，应激反应较成年牛强烈，且该病存在垂直传播。此外，青藏高原地区犊牛感染率较高还与青藏高原高寒缺氧、昼夜温差大、多风雪天气等特殊的气候环境有关；与传统的散养、放养为主的饲养模式，饲养管理条件差等有关。因此，犊牛支原体肺炎的预防应考虑以下几点：首先要特别注意犊牛的饲养管理，避免温度骤变，寒冷和过度拥挤，提高犊牛免疫力；其次，应做好牛群中牛支原体病的监测，及时淘汰病牛，避免牛支原体阳性母牛产犊，切断垂直传播途径；最后，应尽量避免牛只特别是犊牛的远距离运输，减少应激反应造成的牛支原体感染。

从不同性别牦牛血清抗体阳性率检测结果来看，甘肃省雌性阳性率高于雄性，且差异显著(P<0.05)；四川、西藏、青海不同性别比较，其阳性率差异不显著(P>0.05)。从总体结果来看，雌性总体平均阳性率高于雄性，但差异不显著(P>0.05)。谢建华[10]等人的研究结果表明，奶牛的易感性高于肉牛。其原因可能与雌性在妊娠、分娩过程中自身抵抗力较低，且容易患乳腺炎等因素有关。

自1962年Hale[11]等人首次从乳房炎病牛乳中分离到牛支原体以来，牛支原体相关疾病在多个国家相继出现并被报道，其中以欧洲最为严重。据资料显示，在欧洲有1/4～1/3的犊牛肺炎是牛支原体引起；在美国，单个牛场牛支原体感染率可高达70 %，由此引发的奶牛乳腺炎和牛呼吸道疾病给养殖业造成了巨大损失[12]。目前，牛支原体已经呈世界性分布，在越来越多的国家、地区流行和报道，在全球的分布亦呈现持续感染和逐年上升趋势。

4 结 论

本次试验结果表明，我国四川、甘肃、西藏、青海在内的牦牛主产区内，牦牛感染牛支原体较普遍，以四川和甘肃最为严重，且四川、西藏和青海呈现逐渐上升趋势。1岁以下牦牛易感性最强；雌性比雄性易感性强。因此，我国青藏高原牦牛群存在较大的牛支原体感染风险，应特别注意犊牛和母牛的饲养管理，采取综合性防治措施，预防和控制该病的发生和蔓延。由于项目资金等问题，本次流行病学研究未包含我国新疆和云南两地，有待后续进一步调查研究和完善。