新疆穗花婆婆纳白粉病病原鉴定

李妍 海艳 方治豪 王凯涛 任毓忠

摘 要 为了研究新疆石河子地区穗花婆婆纳白粉病菌的系统进化关系，为其防治和系统进化提供理论依据，采用显微形态学观察、分子生物学检测的方法对其进行鉴定，并构建系统进化树进行分析。结果表明，该病原菌分生孢子梗直立，上串生3～5个孢子，分生孢子椭圆形到卵圆形，大小为（24～35）μm×（12～19）μm。闭囊壳球形，暗褐色，69～82 μm，附属丝菌丝状，無分支，着生于闭囊壳的下部，7～9根，长度是闭囊壳直径的1～3倍。闭囊壳内有一个子囊，子囊近球形或椭圆形，无足胞或柄，内含4～8个子囊孢子，子囊孢子卵圆形至椭圆形。根据病原菌的rDNA-ITS序列（566 bp）建立发育树分析可知，其与Podosphaera_fuliginea（登录号MF543026和AB046986）聚在1个进化支上，且序列同源性99.0%以上。基于形态学观察和分子生物学测定，将引起石河子地区穗花婆婆纳白粉病的病原鉴定为单囊壳白粉菌（Podosphaera. fuliginea）。

关键词 穗花婆婆纳;白粉病菌;病原鉴定;Podosphaera_fuliginea

中图分类号：S432.2+2 文献标志码：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2020.09.066

穗花婆婆纳（Veronica spicata）属于玄参科（Scrop-

hulariaceae）婆婆纳属，多年生草本，喜光，耐半阴，耐寒、耐旱及瘠薄土壤，花蓝色，是近几年从国外引进，适宜我国北方地区的优良宿根花卉。穗花婆婆纳株形紧凑，花枝优美，花期恰逢仲夏缺花季节，在炎热的夏季开花不断，以弥补夏秋季花卉稀少的现状，是布置花坛、花镜的优良材料，具有很高的推广应用价值[1-3]。但随着该种花卉的引进和大面积栽植，为许多花卉病害的传播扩散提供了便利，白粉病就是其中之一。白粉病是由白粉病菌专性寄生于植物上导致的真菌病害，主要侵染的花卉植物的地上部分，影响花卉的观赏价值和产量[4-7]。2018年夏季，观察到新疆石河子市区穗花婆婆纳有白粉病为害，病菌感染叶部及茎秆，严重时整个植株都被白粉层覆盖，影响到了植株叶片的光合作用，可能导致其提早干枯死亡，观赏价值降低。国内外关于穗花婆婆纳白粉病的病原主要有单囊壳白粉菌（Podosphaera. fuliginea）和奥伦特高氏白粉菌（Golovinomyces orontii）[8-9]。但引起新疆地区穗花婆婆纳白粉病的研究还未见报道。因此，有必要对引起新疆地区的穗花婆婆纳白粉病的病原进行鉴定，明确病害的在当地的分布、为害和发生规律，为穗花婆婆纳白粉病防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

本试验于2018年7—9月在石河子大学进行，穗花婆婆纳白粉病标本采自新疆石河子市区明珠河公园内，采集田间有白粉病症状的样本带回室内进行鉴定。

1.2 病害症状观察

从病害发生初期开始，每隔一段时间观察田间病害的症状变化及病害发生情况，包括发病部位、病斑颜色、病斑大小、病株的生长状况以及闭囊壳的产生情况等[10-11]。

1.3 病原菌形态学观察

采用粘贴法观察病原菌形态特征。用透明胶带粘取新鲜病斑，以水作浮载剂，在显微镜下观察病原菌菌丝及附着胞、分生孢子、分生孢子梗，并测量相关数据和制作临时玻片对玻片进行保湿处理观察其芽管着生方式。另外，用解剖针挑取或用胶带粘帖闭囊壳，显微观察并测量闭囊壳的形状、大小，附属丝的形态、数量、长度，闭囊壳内子囊的数量、形态、大小以及子囊内子囊孢子的数量、形态、大小等。依据观察和测定结果，参照白粉病菌鉴定特征[12-19]，确定引起穗花婆婆纳白粉病的病原。

1.4 病原菌rDNA ITS片段的PCR扩增和序列测定

1.4.1 病菌基因组DNA的提取和PCR扩增

采集新鲜发病的叶片后，在室内用干净的毛笔将叶片上的病菌收集，用BioFlux公司真菌基因组DNA提取试剂盒提取大花金鸡菊白粉病病原菌基因组DNA。ITS区通用引物为ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）、ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′），由上海生工生物工程有限公司合成，PCR扩增ITS区片段，电泳观察目标片段的大小[20-21]。

1.4.2 病菌rDNA-ITS区序列的分析

将PCR扩增后的目标片段送交上海生工生物工程有限公司进行测序，测序后的结果在NCBI的GenBank核酸数据库中进行BLAST，获得与该序列同源性较高的ITS区序列，同时通过查阅资料，下载已报道的能引起婆婆纳属植物白粉病的病菌ITS区序列，用Mega 6.0软件进行序列比对和系统发育树构建[22]。

2 结果与分析

2.1 病害症状

发病初期叶片正面、背面及茎秆均产生白色稀疏的菌丝（图1-A、B），后期随着条件适宜，菌丝逐渐浓密并扩大至整个叶面，即为病原菌分生孢子、分生孢子梗和菌丝体，受害叶片颜色加深，为紫褐色（图1-C）。同时叶片背面产生黑色小粒点，即闭囊壳，闭囊壳多聚集产生，少散生在叶片背面（图1-D）。发病后期，整株叶片和茎秆表面被白粉层覆盖，茎秆变为褐色并干枯，叶片卷曲，变脆，转为浅褐色甚至干枯，严重影响了穗花婆婆纳的观赏价值和观赏时长。

2.2 病原的形态特征

在显微镜下进行形态观察，穗花婆婆纳白粉病的病原特征表现如下：白粉病菌的无性世代菌丝无色或淡色，宽2.44～7.32 μm，附着胞乳突状，常单生，偶对生（图2-A），分生孢子梗直立，不分枝，长为65～154 μm（图2-B），上部串生3～5个分生孢子。分生孢子单胞透明，椭圆至卵圆形、桶形，表面无纤维状体，大小为（24～35）μm×（12～19）μm（图2-C）。其有性世代闭囊壳多聚生少散生在叶片背面，球形，暗褐色，69～82 μm，附属丝菌丝状，生于闭囊壳的下部，直或稍弯曲，无分支，7～9根，0～4个分隔，附属丝基部细胞颜色较深，顶端细胞无色透明，长107～250 μm，是闭囊壳直径的1～3倍（图2-D、E）。闭囊壳内有一个子囊，子囊近球形或光椭圆形，无足胞或柄（图2-F），子囊大小为（60～85）μm×（50～64）μm，内含4～8个子囊孢子，子囊孢子单胞无色，卵圆形至椭圆形，大小为16～24×10～20 μm（图2-F）。该病菌形态特征与刘铁志[8]报道的寄生在玄参科大婆婆纳上的单囊白粉菌（Podosphaera fuliginea异名单囊壳）基本一致，初步鉴定引起新疆穗花婆婆纳白粉病的病原为单囊白粉菌（P. fuliginea）。

2.3 rDNA-ITS区序列的测定和分析

对穗花婆婆纳白粉病菌rDNA-ITS区序列进行PCR扩增，获得了566 bp的DNA片段，将测序后的结果在NCBI的GenBank核酸数据库中进行BLAST比对，结果显示，该序列与已登录的来自中国和日本寄生穗花婆婆纳的单囊白粉菌（Podosphaera fuliginea，登录号MF543026和AB046986）同源性最高达99.0以上，而与寄生于婆婆纳属植物上的其他白粉病菌（Golovinomyces orontii登录号分别为AB077652、DQ386696、KF056820和KY660776）亲缘关系较远，与其他单囊壳属白粉菌（Podosphaera）处于不同的分支上（图3）。由此进一步证明，引起新疆石河子市区穗花婆婆纳白粉病的病原为单囊白粉菌（Podosphaera fuliginea）。

3 结论与讨论

国内外对于婆婆纳属植物上白粉病病原的研究结果存在一定的差异，其主要病原有两种，即单囊壳白粉菌（P. fuliginea）和奥伦特高氏白粉菌（G.orontii）[4-5];

P. fuliginea只在中国内蒙古和日本的穗花婆婆纳上有发现，G.orontii在中国和英国的波斯婆婆纳（V. persica）、意大利的穗花婆婆纳以及日本的直立婆婆纳（V.arvensis）都有寄生和为害的报道（部分信息来自NCBI）。为进一步确认引起新疆石河子市穗花婆婆纳白粉病的病原分类地位，本试验基于病菌形态特征观察结合分子系统学方法，分析了新疆穗花婆婆纳白粉病病原菌与其他相关类群rDNA-ITS区序列的系统发育关系[19-20]，

最终明确了引起新疆穗花婆婆纳白粉病的病原菌为单囊白粉菌（Podosphaera fuliginea）;该结论与刘铁志[8]鉴定的引起内蒙古穗花婆婆纳白粉病的病原一致。这是穗花婆婆纳白粉病在新疆的首次发现。今后需对白粉病在新疆的主要发生规律进行系统调查研究，以便为该病害的防控提供依据。

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（责任编辑：赵中正）

收稿日期：2020-02-21

基金项目：国家自然科学基金项目（31160357）;兵团林业局项目（KC009903）;石河子大学大学生创新创业训练计划项目（SRP2018026）。

作者简介：李妍（1997—），女，陕西礼泉人，本科在读，研究方向为植物保护。

※为通信作者，E-mail： 404350315@qq.com。