胶质瘤中BRAF基因异常的研究进展

孙梦雪 王雷明 滕梁红

(首都医科大学宣武医院病理科,北京 100053)

胶质瘤是最常见的中枢神经系统肿瘤类型，占原发颅内肿瘤的50%～60%，近年来发病率正在呈现逐步上升的趋势[1]。由于颅内肿瘤部位的特殊性，在胶质瘤治疗手段的选择上受到很大限制，治疗效果也差强人意。目前，随着对肿瘤分子水平研究的不断深入，越来越多的分子遗传学特征在肿瘤的诊断、治疗及预后评估等方面发挥重要的指导作用[2]。丝氨酸/苏氨酸激酶v-RAF鼠肉瘤病毒致癌基因同源物B1(the serine threonine kinase v-RAF murine sarcoma viral oncogene homologue B1，BRAF)基因异常是较为常见的肿瘤相关性分子改变，其中BRAFV600E点突变在包括甲状腺乳头状癌、黑色素瘤、结直肠癌、毛细胞白血病等多种肿瘤中均被检测到，并且已经成为重要的治疗靶点[3]。而近些年来，在一些特殊的胶质瘤类型中也陆续发现了BRAF基因的异常，这其中除了常见的BRAFV600E点突变，还包括BRAF基因融合[4]。这些发现为胶质瘤的诊断及综合治疗提供了新的手段和方向。本文将目前BRAF基因异常在胶质瘤诊断和治疗中的应用进展做一综述。

1 胶质瘤中BRAF基因的异常

BRAF基因位于染色体7q34，与ARAF基因及CRAF基因共同构成了RAF基因家族。其编码的BRAF蛋白参与肉瘤病毒癌基因(rat sarcoma viral oncogene，RAS)-RAF-丝裂原活化的细胞外信号调节激酶(mitogen activated extracellular signal regulated kinase，MEK)-细胞外信号调节激酶(extracellular signal regulated kinase，ERK)-有丝分裂原激活蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK),即RAS-RAF-MEK-ERK-MAPK通路的调节。MAPK通路开始于跨膜受体酪氨酸激酶的活化，并通过与酪氨酸激酶受体结合以及自磷酸化激活RAS，进而激活RAF及下游的MEK1/2,最终导致ERK1/2转录复合物的激活，引起细胞的增生及肿瘤的发生。但另一方面，当该通路下游的抑癌基因p16INK4a、p19ARF、p53 和PTEN等发挥作用时，又可以引起细胞的分化及衰老。当BRAF基因出现异常时，不需要RAS的活化就可以激活下游的信号分子，MAPK通路持续活化，该机制被认为与包括胶质瘤在内的多种肿瘤的发生均有关[5]。目前已知的与胶质瘤相关的BRAF基因异常主要包括BRAF突变和BRAF融合。

BRAFV600E突变是一种错义突变，是第600位的谷氨酸替代了缬氨酸，这也是BRAF突变最常见的(约占90%)一种突变形式。BRAFV600E突变导致高水平的BRAF激酶活性和高水平的磷酸化和活化ERK，使MAPK通路持续激活，促进肿瘤的发生。BRAFV600E突变激活MAPK 信号的能力与RAS活性无关。事实上，在BRAFV600E突变的细胞中发现RAS活性水平被抑制，这是由于下游的ERK被激活，产生强烈的负反馈所致[5]。

BRAF的融合在2008年才被首次报道[4]。Jones等[4]描述了1例毛细胞星形细胞瘤中位于7q34上2Mb的串联重复序列，并证实是BRAF与同在一条染色体上的基因KIAA1549之间出现了融合。BARF与KIAA1549最常见的融合位点是KIAA1549的16号外显子和BRAF的9号外显子融合，其次还有15-9和16-11等方式。随后研究者[4，6-7]发现BRAF基因融合时，RAF的N端可以被KIAA1549、FAM131B、SRGAP3或GTF2I等替代，RAF的N端自抑制域丢失，解除了对C末端结构域的抑制，使MAPK通路异常激活，随后，Shin 等[8]在小鼠模型上又发现，C末端激酶结构域本身的激活可能还不足以具有致瘤性，但协同 Ink4a(p16)/Arf(p14)的丢失却可导致胶质瘤的发生。

2 BRAF V600E基因突变在胶质瘤中的意义

BRAFV600E基因突变是肿瘤中比较常见的分子改变，发生于人类约7%的恶性肿瘤，包括毛细胞白血病(几乎100%)、黑色素瘤(约45%)、甲状腺乳头状癌(约45%～70%)、结直肠癌(8%～15%)及非小细胞肺癌(2%～5%)等[3]。在一些中枢神经系统肿瘤，如胶质瘤、脑膜瘤、乳头型颅咽管瘤中也较为常见。在胶质瘤中,BRAFV600E突变主要发生在一组异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase，IDH)野生型的胶质瘤，包括毛细胞型星形细胞瘤(pilocytic astrocytomas,PA)(12.5%)、节细胞胶质瘤和间变型节细胞胶质瘤(ganglioglioma，GG)(50%)、多形性黄色星形细胞瘤(pleomorphic xanthoastrocytoma，PXA)(约55%)、上皮样胶质母细胞瘤(epithelioid glioblastoma,eGBM)(58%)等[9-10]。详见表1。值得注意的是，在这组肿瘤中，除了毛细胞型星形细胞瘤以外，BRAFV600E突变主要见于一组形态上以上皮样细胞为特征的胶质瘤(间变性GG、PXA、间变型PXA和上皮样胶质母细胞瘤)。这几种肿瘤的组织学级别及预后不一，但在形态及分子特征上却存在一定的相似性，而且陆续出现了一些它们之间存在相关性的报道。Tanaka等[11]曾报道了1例具有BRAFV600E突变的PXA患者手术后13年发展成eGBM，另一项研究[12]中也报道了1例由间变型PXA发展成eGBM的病例。关于PXA和GG的相关性也有报道，如Cicuendez等[13]及王雷明等[14]均报道过混合性PXA-GG的病例，也提示两种肿瘤可能存在一定的同源性。2018年Murakami等[15]首次报道1例具有上皮样细胞的间变型节细胞胶质瘤，上皮样细胞和神经节样细胞均检测到BRAFV600E突变，因此认为节细胞胶质瘤可能是上皮样胶质母细胞瘤的前驱病变，这些形态学和分子层面证据的出现也提示这几种肿瘤可能属于同一疾病谱系。由于BRAFV600E突变在世界卫生组组(World Health Organization， WHO)I～IV级的多种胶质瘤中均可出现，因此在鉴别诊断中的意义有限，但在一些特定情况下却对病理诊断很有帮助。例如：在低级别的弥漫性胶质瘤(WHOⅡ级 )累及大脑皮质时，需要和节细胞胶质瘤(WHOⅠ级)进行鉴别，如果存在BRAF的突变，则支持后者；PXA(WHOⅡ～Ⅲ)或上皮样胶质母细胞瘤和巨细胞胶质母细胞瘤(WHO Ⅳ级)都可以出现胞质丰富的上皮样细胞，但巨细胞胶质母细胞瘤通常不具有BRAF的突变[16]。

检测BRAFV600E突变在预后方面的价值主要体现在儿童胶质瘤中，目前研究者[17]认为BRAFV600E突变是一种预后相对较差的标志物，比如发生于脑干BRAFV600E突变的GG(WHOⅠ级)复发率要高于野生型；儿童间脑BRAFV600E突变的低级别胶质瘤更具侵袭性，尤其是13岁以下的儿童[18]。但是也有研究者发现在儿童中线的胶质瘤中,当存在H3K27M和BRAFV600E双重突变时，相对于H3K27M单一突变的弥漫中线胶质瘤，患者具有更长的生存期[19]。因此对于同一病例中同时出现多个基因改变的临床意义尚需更多的研究和数据。

表1 胶质瘤中BRAF基因的异常改变[9-10]

BRAF： the serine threonine kinase v-RAF murine sarcoma viral oncogene homologue B1；WHO： World Health Organization；PA: pilocytic astrocytoma；GG:ganglioglioma；PXA: pleomorphic xanthoastrocytoma；eGBM: epithelioid glioblastoma；PMA: pilomyxoid astrocytoma；DLGNT: diffuse leptomeningeal glioneuronal tumor.

对于存在BRAFV600E突变的胶质瘤，已经有研究者[20-21]尝试将其作为治疗靶点进行靶向治疗。如BRAF抑制剂维罗非尼(Vemurafenib)和达帕菲尼(Dabrafenib)已被美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration， FDA)批准用于BRAFV600E突变的晚期恶性黑色素瘤患者[20]。Kaley等[21]的研究表明Vemurafenib对BRAFV600E突变的胶质瘤患者具有较持久的抗肿瘤活性，但在不同的组织学类型中治疗效果不同，其中以PXA患者治疗效果最好。此外，也有单独应用Dabrafenib成功治疗BRAFV600E突变胶质瘤以及复发性恶性胶质瘤的个案报道[22]。同时有研究[23]结果显示对于BRAF抑制剂耐药的患者，MEK抑制剂曲美替尼(Trametinib)联合BRAF抑制剂Dabrafenib可以克服单药治疗的耐药性。

3 BRAF基因融合在胶质瘤中的意义

BRAF基因融合最常见的配体是KIAA1549基因，该基因目前的功能尚不明确，但两者可以通过串联重复导致KIAA1549-BRAF融合。胶质瘤中，KIAA1549-BRAF融合主要发生在毛细胞型星形细胞瘤(>70%)及弥漫性软脑膜胶质神经元肿瘤(75%)，其他常见的还包括毛黏液样型星形细胞瘤(40%～50%)和节细胞胶质瘤(18%)。详见表1。PA中最常见的KIAA1549-BRAF融合形式是 16-9外显子融合，且多发生于小脑，而外显子15-9融合常出现在中线部位[24-25]。有研究者[26]认为BRAF基因融合形式与组织病理学形态存在相关性，KIAA1549-BRAF融合与PA中毛细胞形态有一定的联系， 外显子16-9融合更容易形成双相模式，而外显子15-9融合更多见于富于黏液的肿瘤。KIAA1549-BRAF融合在PA中的高检出率，在PA与儿童低级别弥漫性胶质瘤的鉴别诊断中发挥了重要作用[27]。此外，目前的研究[25]也显示，KIAA1549-BRAF融合的胶质瘤倾向于更长的无进展生存期。另有研究[28]表明应用KIAA1549-BRAF融合的高检出率有助于PA的进一步研究，比如有研究通过激光显微切割，获得PA患者手术切除标本中增生的微血管成分和肿瘤细胞成分，分别检测KIAA1549-BRAF融合，结果提示增生的微血管的某些细胞成分可能与肿瘤细胞具有同一起源。BRAF基因融合的配体除KIAA1549外，近几年还陆续发现一些其他的配体基因，如eFAM131、SRGAP3、RNF130、CLCN6、MKRN1、GNAI1、GTF2I等，不同的配体在肿瘤发生过程中的作用可能有所差别，但目前由于发现其他配体的多是个案报道，尚无法判断其对胶质瘤发生、发展及预后的影响差异[7]。

目前，BRAF抑制剂对KIAA1549-BRAF基因融合相关的胶质瘤治疗效果欠佳。具有KIAA1549-BRAF基因融合的星形细胞瘤细胞系对BRAF抑制剂Vemurafenib(研究类似物PLX4720)具有天生的耐药性，在PLX4720治疗后反而被矛盾地激活，导致肿瘤细胞加速生长[29]。Jain等[30]研究结果显示PI3K-AKT-mTOR信号级联是BRAF融合的主要逃避机制，正在进行的临床试验也证实联合应用Trametinib和依维莫司(Everolimus,mTOR抑制剂)可延缓肿瘤生长速度，抑制、延缓肿瘤获得性耐药的产生。

4 BRAF基因异常的检测

BRAFV600E突变的检测方法包括多种[31-33]。在临床上应用最广泛的是免疫组织化学染色法，通过检测BRAF V600E突变蛋白的表达来间接反映BRAFV600E基因突变情况。检测成本相对低廉，检测快速，操作简便，灵敏度和特异度均较高[31]，但结果的判读有时依赖于染色的质量，主观性较强。直接测序法特异度较高，但操作较复杂，耗时长，灵敏度稍差，目前在临床工作中应用的并不广泛。实时聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)虽然灵敏度较高，但具有较差的特异度，因为它是通过扩增的突变基因序列来间接识别的[32]。Bisschop等[33]的研究表明Idylla检测法不仅可以识别BRAFV600E突变，还可以检测到BRAF其他位点的突变，其检测过程无须进行DNA分离，适合BRAF基因突变的快速检测，但其价格昂贵，临床推广较为困难。

目前对于KIAA1549-BRAF基因融合的检测临床上应用最多的仍然是荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization， FISH)检测法，检测与融合伙伴、融合连接、重排片段大小以及融合基因表达均无关，操作方便、可以直观观察，但缺点在于不能判断融合伙伴。检测BRAF基因融合的FISH探针包括分离探针和融合探针两种类型，分离探针可以检测出未知片段融合，略优于融合探针，但仍无法判断具体的配体基因。RNA测序法是检测重排最基础、最直接及最准确的方法，但其主要限制是需要新鲜标本，以及不能检测到涉及非转录区域的重排事件。此外，由于表达的动态范围广，组织特异性强，低水平表达的融合基因也难以检测到。Nano String技术是多重基因定量检测技术，此技术可直接检测条形码探针标记的单个mRNA转录子，不需要扩增就可以单独计数，其特异度及灵敏度较高，而且对于冰冻切片及石蜡切片都有功能，因此，也是BRAF融合检测的方法选择之一，但其缺点也是无法检测未知的融合[34-35]。

5 结语

BRAFV600E突变及KIAA1549-BRAF融合在不同胶质瘤中发生率不同，而且检测方法简便，在胶质瘤的诊断、预后及治疗等方面发挥重要作用。BRAFV600E突变在GG、PXA及上皮样胶质母细胞瘤等胶质瘤中的高检出率可以辅助胶质瘤病理分型，同时对于儿童胶质瘤的预后有一定提示意义。虽然目前BRAF抑制剂在胶质瘤中的应用仅有个案报道，但其为胶质瘤的治疗打开一条新的思路。KIAA1549-BRAF基因融合检测不仅可以用于儿童低级别的胶质瘤的诊断和鉴别诊断，也可用于与之相关机制的深入研究。