HBV相关慢加急性肝衰竭患者糖皮质激素受体表达特征及其与疗效的关系

董金玲， 贾 琳， 杨 君， 于红卫， 胡中杰， 朱跃科， 孟庆华

首都医科大学附属北京佑安医院 肝病重症医学科， 北京 100069

HBV相关慢加急性(亚急性)肝衰竭(hepatitis B virus related acute-on-chronic liver failure，HBV-ACLF)是我国临床最为常见的肝衰竭类型。糖皮质激素(glucocorticoid，GC)治疗HBV-ACLF在国内外研究中仍存在很大争议[1]，GC与糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor,GR)结合后才能发挥其生物学效应。不同研究表明GC敏感性与GR亚型表达相关，本研究采用前瞻性、非随机对照入组的研究方法，通过检测GR及其亚型GR-α、β的表达，探讨GC治疗HBV-ACLF早、中期患者GR亚型表达特征及其与疗效的关系，为GC在临床中的科学合理应用提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象 入组2015年9月-2018年6月于本院住院治疗的HBV-ACLF患者38例，剔除2例行肝移植者，3例存活超28 d，但未完成28 d观察研究者，剩余33例纳入研究，分为激素组(18例)和非激素组(15例)；激素组根据患者应用7 d短疗程激素后，在第10 d时的临床症状及实验室指标，分为激素敏感组 (13例) 和激素不敏感组 (5例)。

1.2 纳入标准 年龄18～70岁，性别不限；HBV-ACLF早、中期诊断符合《肝衰竭诊治指南(2012年版)》[1]诊断标准：(1)极度乏力，有明显的消化道症状；(2)黄疸迅速加深，血清TBil≥171 μmol/L或每日上升≥17.1 μmol/L；(3)出血倾向， 20%

1.3 排除标准 合并其他病毒感染；入组前2个月不可控制的细菌、真菌感染或胃肠道出血者；自身免疫性疾病，酒精性肝病，药物性肝炎，严重的心脏、肾脏、呼吸系统、神经系统疾病，肿瘤性疾病，其他禁忌激素类药物治疗的疾病(如活动性溃疡病、肺结核等)。

1.4 方法

1.4.1 观察时间点及观察指标 (1)于入院、8 d、10 d、14 d、28 d观察：①患者一般状况、消化道症状、腹水、肝性脑病、消化道出血等情况变化；②肝、肾功能、凝血功能等。(2)于入院、8 d检测GR及GR-α mRNA、GR-β mRNA表达。

1.4.2 治疗方案 (1) 内科综合治疗：保肝、抗病毒(恩替卡韦或富马酸替诺福韦酯)、补充血浆及人血白蛋白、防治感染及并发症、人工肝治疗(应用激素前后10 d未行血浆置换)等。(2) 激素组在内科综合治疗基础上给予甲基强的松龙(辉瑞制药有限公司，Pfizer，NYSE：PFE)1.5 mg·kg-1·d-2，3 d；1 mg·kg-1·d-2，2 d；0.5 mg·kg-1·d-1，2 d，静脉滴注，总疗程7 d。

1.4.3 激素敏感性疗效评价标准及分组 (1)激素疗效反应敏感者：一般观察指标明显改善，PTA>40%或PTA较基线上升>30%，且TBil<10×正常值上限(ULN)或TBil较基线下降>30%[2]。(2)激素疗效反应不敏感者：一般观察指标无改善或较前恶化，TBil和PTA未达激素反应敏感疗效者，或评价时间点前发生死亡者。激素反应疗效敏感者归为激素敏感组，不敏感者归入激素不敏感组。以上标准制订参考已发表的文献和临床实际工作经验。

1.4.4 GR及GR-α mRNA、GR-β mRNA测定 使用流式细胞仪(美国，BeckmanFC500)、流式CD3抗体、固定剂、封闭液、破膜剂(美国,Ebioscience公司)、GR单抗及IgG同型对照(美国,Abcam公司)检测外周血T淋巴细胞GR表达。使用RT-PCR仪(美国,BIORAD)；cDNA合成试剂盒 (TaKaRa公司)、SYBRPremixExTaq及RT-PCR引物检测外周血GR mRNA亚型表达。引物设计及合成，GR-α、GR-β引物设计参照文献[3]，GAPDH引物为大连宝生物公司设计合成(表1)。

表1 引物序列

目的基因的表达水平用2-ΔCt表示，ΔCt=待测标本目的基因的Ct值- 待测标本内参基因的Ct值。每一标本的检测各重复两孔，取两复孔检测的平均值，同时做阴性对照，质控监测，保证实验准确。

1.5 伦理学审查 患者均签署知情同意书，本研究已通过首都医科大学附属北京佑安医院伦理委员会批准，并备案(批号：京佑科伦字〔2018〕020号)。

2 结果

2.1 2组患者基线资料比较 激素组男17例，女1例，非激素组15例均为男性。2组患者基线时年龄、发病至入组时间、TBil、PTA、MELD评分、HBV DNA定量、基线皮质醇水平、感染(腹膜炎、肺炎、胆系感染等)及并发症(浆膜腔积液、肝性脑病、消化道出血、电解质紊乱、急性肾损伤)发生情况差异均无统计学意义(P值均>0.05)(表2)。33例HBV-ACLF患者在28d时共有27例(81.82%)存活，6例(18.18%)死亡，生存曲线显示，激素组与非激素组28 d生存情况差异无统计学意义(88.89%vs 66.67%，P=0.104)；28d激素组主要死亡原因为感染中毒性休克(1例)和肝、肾功能衰竭(1例)，非激素主要死亡原因为消化道出血(1例)、肝性脑病(1例)、感染中毒性休克(1例)和肝、肾功能衰竭(1例)，激素组与非激素组死因差异无统计学意义(P>0.05)。28 d时激素敏感组12例存活(92.3%)，激素不敏感组4例存活(80%)，激素敏感组在第11天时死亡1例，激素不敏感组在第20天时死亡1例。

2.2 2组不同时间点肝功能及凝血指标动态变化比较 激素组与非激素组各指标不同时间点比较,发现激素组TBil明显低于非激素组[8 d:(237.21±142.11) μmol/L vs (385.92±136.66) μmol/L,t=-3.045，P=0.005;10 d:(247.93±173.16) μmol/L vs (393.29±175.76) μmol/L，t=-2.292，P=0.029]。激素组PTA明显高于非激素组(8 d: 52.10%±19.38 %vs 38.52%±12.64%，t=2.329，P=0.027;10 d: 58.40%±20.23% vs 38.52%±12.64%，t=2.329，P=0.027;14 d: 62.17%±22.98% vs 43.85%±13.09%，t=2.484，P=0.019]。而ALT、AST和Alb在各随访点两组间未见明显统计学差异(P值均>0.05)。

2.3 2组患者GR及亚型表达比较 2组基线时GR、GR-αmRNA和GR-β mRNA比较，差异均无统计学意义(P值均>0.05)。激素组8 d时GR-α mRNA和GR-β mRNA表达水平较基线明显降低(t值分别为6.586、1.601，P值分别为<0.001、0.128)；且8 d时GR-α mRNA表达水平激素组明显低于非激素组(P=0.001)(表3)。

2.4 激素敏感组与激素不敏感组不同时间点肝功能及凝血指标动态变化 在不同时间点，激素敏感组TBil和PTA指标改善明显优于激素不敏感组(P值均<0.05)(表4、5)。

表3 2组GR及其亚型比较

注：与基线GR-α mRNA比较，1)P<0.05；与基线GR-β mRNA比较，2)P<0.05。

表4 激素敏感与不敏感组不同时间点TBil比较

表5 激素敏感组与不敏感组不同时间点PTA比较

2.5 激素敏感组与激素不敏感组基线及8 d时GR及GR-α和GR-β mRNA比较 激素敏感组与激素不敏感组患者基线比较，GR表达水平(88.02%±6.31% vs 89.38%±6.90%)、 GR-α mRNA表达水平[(1.95±0.59)×10-2vs (1.97±0.09)×10-2]、 GR-β mRNA表达水平[(0.20±0.11)×10-2vs (0.11±0.04)×10-2]差异均无统计学意义(P值均>0.05)。

激素敏感组与激素不敏感组患者8 d比较，2组GR表达水平差异无统计学意义(86.70%±6.20% vs 88.42%±8.46%，t=-0.477，P=0.640)； GR-α mRNA表达水平在激素敏感组明显高于激素不敏感组[(1.21±0.34)×10-2vs (0.43±0.31)×10-2，t=4.456，P<0.001](图1)；GR-β mRNA表达水平在激素敏感组[(0.14±0.08)×10-2]与激素不敏感组[(0.10±0.04)×10-2]比较差异无统计学意义(t=1.092，P=0.291)(图2)。

2.6 激素敏感组与不敏感组患者GR-α mRNA及GR-β mRNA 水平 8 d时较基线下降幅度比较 激素敏感组GR-α mRNA表达降低幅度明显小于激素不敏感组(t=-2.904，P=0.010)；GR-β mRNA下降幅度在2 组间差异无统计学意义(t=0.665，P=0.516)(图3、4)。

2.7 激素组不同GR-α mRNA表达水平与TBil和PTA变化的关系 8 d时激素组患者GR-α mRNA表达降低幅度与基线的比值均值为46%，据此分为≤46%组(10例)和>46%组(8例)。2组GR-α mRNA表达水平降低幅度与基线的比值差异有统计学意义(26.99%±25.09% vs 70.09%±16.08%，t=-4.203，P=0.001)。

10 d时，TBil降低幅度与基线比值在≤46%组和>46%组间差异有统计学意义(P=0.021)；10 d时，PTA上升幅度与基线比值在≤46%组和>46%组间差异差异有统计学意义(P=0.048)(图5)。

3 讨论

HBV感染占我国ACLF病因80%以上，HBV-ACLF病死率高达62.18%～72.3%[4]。鉴于供体来源和经济条件的限制，能行肝移植术者有限，内科和人工肝综合支持治疗仍然是治疗肝衰竭的主要手段[5]。GC治疗HBV-ACLF仍有争论，但鉴于近年来对GC不良反应及并发症防治手段的增强，核苷类似物等病因治疗的加强，部分医生认为GC可通过抑制细胞毒性T淋巴细胞等淋巴细胞的免疫应答，调节Th1/Th2、Th17/Treg比例来发挥免疫抑制作用，延缓或阻止过强的细胞免疫所致的组织损伤[6]，同时能抑制多种促炎细胞因子如TNFα、IFNγ、IL-1和IL-6产生和释放，增强抑炎因子IL-10的产生与释放[7-8]，补充不足的皮质醇，延缓或阻止继发性的炎症反应发生，提高机体应激耐受能力，为肝细胞再生提供有利条件。因此，GC可作为治疗肝衰竭的一种治疗选择方法。

临床治疗中发现机体对GC反应存在个体差异，除目前大多认为GC疗效可能与治疗人群的选择及开始用GC治疗的时机有关外，考虑与个体GC敏感性相关。GC与GR结合后才能发挥其生物学效应。GR亚型被认为与GC敏感性密切相关，研究[9]发现GR数量及其亚型表达的差异可能影响GC效应。GR主要有GR-α、GR-β两种形式，GR-α占主导地位，是介导GC发挥生物学作用的主要受体。多数研究认为，GC抵抗的发生可能是由于GR-α表达水平下降所引起，如Liang等[10]报道在原发免疫性血小板减少症患者中GR-α表达水平下降与激素抵抗密切相关。而GR-β表达水平极低，不与GC结合，对GC的疗效起负性调节作用，干扰GR-α的功能[10]，并可通过干扰GR-α与转录因子NF-κB和AP-1结合阻碍其发挥作用[11]。但也有部分学者持相反观点，Jakiea等[12]对40例哮喘患者的研究未发现GC抵抗与GR-α、GR-β mRNA及GR-β/GR-α有关。目前国内外对于HBV相关肝衰竭GR及其亚型研究较少，Gao等[13]报道HBV-ACLF患者外周血单个核细胞(PBMC)中GR-α mRNA表达水平显著低于正常人，而GR-β mRNA表达水平显著高于正常人和慢性乙型肝炎患者。激素受体亚型动态变化是否对激素疗效具有预测作用？本研究发现HBV-ACLF短疗程甲强龙治疗HBV-ACLF患者2周内在改善TBil和PTA指标方面明显优于非激素组。激素敏感组TBil与PTA 10 d、14 d和28 d指标改善明显优于激素不敏感组，激素敏感组GR-α mRNA 8 d降低幅度明显小于激素不敏感组，提示应用GC后GR-α mRNA表达水平较基线降低。以GR-α mRNA表达降低幅度占基线百分比均值为界线，GR-α mRNA较基线降低幅越小，对激素敏感。应用GC后GR-α mRNA表达降低与Urzua等[14]报道应用GC治疗Vogt-小柳-原田病后GR-α mRNA表达上升不一致，但激素敏感者GR-α mRNA的表达高于激素不敏感者的结论是一致的。分析原因可能为：(1)本研究患者均为HBV-ACLF患者，疾病人群不同，免疫功能等基础不同；(2)推测GR-α mRNA较基线降低，可能是GC进入细胞膜与有效受体结合后在核定位序列的介导下转入核内发挥生物学效应，消耗了一定数量的GR-α，但同时应用激素反应好的患者可能刺激机体产生较多的GR-α；(3)本研究样本量偏少，应扩大样本量进一步研究激素受体动态变化的趋势及机制。

GR-β可能作为一种潜在的内源性GC效应的拮抗因子，其含量仅占GR-α的0.2%～0.3%，本组资料应用激素后GR-β表达变化趋势与GR-α一致，对激素疗效结果影响较小。本研究发现HBV-ACLF早、中期患者使用糖皮质激素后GR-α mRNA表达水平明显降低，激素敏感组患者GR-α mRNA水平较基线降低幅度小，有利于肝功能改善，这对于判断患者使用激素的疗效具有一定指导意义，为远期是否选择进行移植术提供一定理论依据。激素与受体结合发挥生物学效应远不止与激素受体亚型表达有关，是一个极其复杂庞大的通路在发挥作用，任何处于通路中的相关因素都可能影响激素的疗效，应深入对此通路进一步研究。