免疫反应与炎症损伤在肝衰竭发病机制中的作用

王挺帅， 王 娜， 张荣臻,， 王明刚， 黄少东， 马玉珍， 吴 聪， 毛德文

1 湖南中医药大学 研究生学院， 长沙 410000; 2 广西中医药大学第一附属医院 肝病一区， 南宁 530023;3 广西中医药大学 研究生学院， 南宁 530023

肝衰竭是多种因素引起的严重肝脏损伤，导致合成、解毒、代谢和生物转化功能严重障碍或失代偿，出现以黄疸、凝血功能障碍、肝肾综合征、肝性脑病、腹水等为主要表现的一组临床症候群[1]。在我国引起肝衰竭的主要病因是肝炎病毒(主要是HBV)，其次是药物及肝毒性物质(如乙醇、化学制剂等)[1-2]。基于病史、起病特点及病情进展速度，肝衰竭可分为4类：急性肝衰竭(ALF)、亚急性肝衰竭(SALF)、慢加急性(亚急性)肝衰竭(ACLF)和慢性肝衰竭(CLF)[1]。目前，肝衰竭的发病机制尚未完全明确，免疫损伤、缺血缺氧和内毒素血症在肝衰竭发生、发展的过程中起着重要作用，主要通过两条作用途径：一是直接损伤肝细胞导致肝细胞死亡；二是激活体内免疫炎症反应间接造成肝细胞损伤和死亡[3-5]。

近年来，越来越多的学者倾向于“以免疫炎症损伤为核心的二次打击学说”，即在病毒、病原体、毒性因子等对肝细胞直接损伤的基础上，通过肠源性内毒素介导的“内毒素→免疫机制→细胞因子风暴”，产生过度、持久的免疫炎症反应，进而对肝脏造成“二次打击”，最终导致了肝衰竭的发生[6]。肝衰竭存在复杂的免疫、炎症反应过程，肝脏固有免疫细胞可吞噬、杀伤病原体，从而维持内环境稳定；过度的免疫反应导致炎症因子水平增加，进而促进炎症因子风暴形成，加重肝衰竭；肝脏代偿性免疫抑制，免疫功能紊乱导致患全身炎症反应综合征和脓毒症风险提高。本文就免疫反应和炎症损伤在肝衰竭发病机制中的作用进行综述。

1 免疫调节与肝衰竭

肝脏在免疫调节和宿主防御中起着重要作用，既可保护宿主免受感染，也可防止微生物及其产物经胃肠道-门静脉流入肝脏/体循环[7]。天然免疫系统是抵御病原体入侵和其他潜在威胁的第一道防线。多种天然免疫细胞间的精细协调对于有效地消灭和清除入侵病原体和其他分子威胁至关重要。肝脏富含天然免疫细胞，如巨噬细胞、Kupffer细胞、中性粒细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)和树突状细胞(DC)等；适应性免疫细胞包括B淋巴细胞、T淋巴细胞、调节性T淋巴细胞(Treg)、辅助性T淋巴细胞(Th)17等，对微生物病原体及其产物有独特的免疫反应，影响肝衰竭的发生发展过程。

1.1 先天性免疫

1.1.1 巨噬细胞 巨噬细胞是肝脏中重要的抗原递呈细胞，Kupffer细胞占肝内巨噬细胞总数的80%～90%[8-9]。Kupffer细胞具有大量的病原识别受体(pattern recognition receptors, PRR)、补体受体和Fc受体，通过这些受体以增强吞噬活性和产生炎性细胞因子，在免疫调节、组织修复和肝脏再生等方面具有重要作用[10-11]。Toll样受体4(TLR4)主要在巨噬细胞上表达，在介导巨噬细胞活化和促炎细胞因子的产生中起重要作用。无论什么原因所致肝衰竭都伴随着肠上皮屏障完整性的破坏，无论是直接的细胞毒性或是肠道微生态紊乱，都会增加肝脏的负担[12-13]。在ACLF过程中，PRR和损伤相关分子模式(damage associated molecular pattern, DAMP)联合作用引起的损伤是导致ACLF多器官损伤和衰竭的主要原因，组织损伤和细胞死亡又可进一步加剧DAMP及炎症状态，造成恶性循环[14]。

1.1.2 中性粒细胞 中性粒细胞是血液中含量最丰富的天然免疫细胞，其吞噬和清除细菌病原体的能力是天然免疫的关键一环[15]。中性粒细胞可发挥胞外抗菌作用以限制各种抗菌性颗粒蛋白的扩散，从而减少中性粒细胞引起的组织损伤，但同时中性粒细胞的形成及清除障碍募集级联反应又会加重炎症损伤程度[16]。有研究[17]发现，ACLF患者中性粒细胞功能障碍与死亡率增加之间存在相关性。王福生教授团队[18]发现ACLF患者(除外合并腹膜炎、肺炎、肠炎等感染)的中性粒细胞/淋巴细胞比值显著高于健康对照组与慢性乙型肝炎组，且比值随着临床分期的加重而升高。因此，中性粒细胞上调促使慢性肝病患者易受感染，也可能促进胃肠道的失调，增加循环中的微生物或微生物成分的数量，从而使慢性肝病的不适状态持续下去，有助于增加发展CLF、ACLF的风险。

1.1.3 自然杀伤细胞(NK细胞) NK细胞占肝脏淋巴细胞总数的一半，其数量远高于在外周血中[19]。NK细胞可表达多种激活和抑制性免疫受体，是调节肝脏免疫活性的关键前哨细胞[20]。NK细胞在ACLF病理过程中的作用较复杂，一方面，活化的NK细胞可通过增强细胞毒性而导致肝细胞损伤和死亡[21]；另一方面，NK细胞功能减弱的ACLF患者由于免疫反应削弱而更易受感染[22]。有研究[23]发现，NK细胞在ALF和HBV-ACLF的发病机制中起着关键作用，大量NK细胞从外周血、脾脏和骨髓中进入肝脏；同时，随着细胞内IFNγ和TNFα的产生，NK细胞的细胞毒活性也显著增强；其中Fas/FasL和NKG2D/NKG2D配体通路参与了肝脏NK细胞介导的肝细胞损伤。

1.1.4 树突状细胞(DC) DC是一种特异性抗原递呈细胞，在肝脏中较为丰富。在正常生理条件下，肝内DC可以维持肝脏的免疫耐受环境；当病毒等病原体感染后，过量的免疫反应又可致肝损伤[24]。DC主要分为2种：髓样DC和浆性DC，前者主要发挥抗原递呈功能，后者在于局部的免疫调节作用。李保森等[25]发现HBV-ACLF患者肝内浸润大量的浆性DC和髓样DC，并优先分泌IL-10，发挥局部的免疫调节作用。除此之外，DC细胞有趋炎性效应，炎性组织中趋化因子的分泌增加可诱导DC的移位和聚集，髓样DC可以通过激活初始T淋巴细胞分化成Th1或Th17，从而增强肝脏的免疫应答；然而，调节性DC由于表面分子表达量低，会诱导初始T淋巴细胞向Treg分化，起反向调控免疫反应的作用，导致免疫耐受或不应答[26-27]。

1.2 适应性免疫

1.2.1 T淋巴细胞 T淋巴细胞是来源于骨髓的多能干细胞(胚胎期则来源于卵黄囊和肝)，在胸腺内发育为T淋巴细胞，随后移行至外周免疫器官的胸腺依赖区定居，并可经淋巴管、外周血和组织液等进行再循环，发挥免疫调节功能[28]。依据T淋巴细胞表面标志物及生物学功能的不同，可分为多种亚群，包括Th、抑制性T淋巴细胞、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)等[29]。与肝衰竭存活组相比较，肝衰竭死亡组患者外周血CD3+、CD8+T淋巴细胞和CD4+/CD25+Treg比值降低更显著，提示肝衰竭的发生发展过程与免疫功能密切相关[30]。

1.2.2 调节性T淋巴细胞(Treg) Treg在调控肝脏免疫应答中也起着至关重要的作用。CD4+CD25+Treg可通过TGF依赖性途径限制ConA致肝损伤模型的肝损伤，IL-10也可通过表达CD4+CD25+Treg和Kupffer细胞，在ConA致肝损伤的肝脏耐受诱导中起重要作用[31]。Stoop等[32]研究发现，慢性乙型肝炎患者外周血CD4+T淋巴细胞中Treg比例明显高于恢复期患者和健康人群，且Treg的比例及数量与血清HBV DNA的含量呈正相关；同时Treg能抑制HBV特异性T淋巴细胞反应，促进HBV持续慢性感染。在ACLF患者中，外周血CD4+CD25+Treg数量明显低于HBV感染者，提示ACLF的发病机制可能由于患者外周血CD4+CD25+Treg数量过低从而引起CTL扩增失去控制，激发强烈的CD8+CTL反应，从而导致大量的肝细胞坏死，最终触发凋亡机制引起肝细胞大量凋亡[33-34]。

1.2.3 辅助性T淋巴细胞(Th)17 Th17主要是在TGF和IL-6共同诱导下分化产生的，通过分泌细胞因子(主要为IL-17、IL-21、IL-22)以促进中性粒细胞的动员、招募及活化，从而介导促炎反应[35]。Th17和Treg不仅在发育过程中，而且在其效应功能上也存在相互关系。TGFβ可诱导Treg特异性转录因子Forkhead box P3(FOXP3)，而TGFβ中加入IL-6可抑制Treg的生成，诱导Th17，这提示Th17/Treg之间的良好平衡是维持免疫稳态的关键[36]。Zhai等[37]研究显示，ACLF患者外周血Th17和FoxP3(+)Treg均增加，且Th17与Treg的比值与ACLF患者的生存率成反比。有研究[38]发现，Th17相关的炎症与抗原递呈细胞分泌的IL-23水平呈正相关，IL-23是Th17扩增及维持促炎性应答所必需的细胞因子。

2 炎症反应与肝衰竭

炎症反应在肝衰竭的发生发展过程中起重要作用[39]。ACLF患者血清中多种促炎细胞因子(包括TNFα、IL-1β、IL-6、IL-8和单核细胞趋化蛋白1)水平明显升高；同时，抗内扰介质如IL-10升高，但抗内扰代偿机制不足以抵消刺激反应拮抗肝衰竭的进程[40]。目前认为，炎症反应通路可概括为“炎症诱导物→感受细胞→炎症介质→靶组织”4个步骤。炎症反应是一个多因素-多细胞-多通路-多层次的复杂病理生理反应，且与肝脏的免疫调节密切相关。

2.1 炎症诱导物 外源性炎症诱导物主要为病原体相关分子模式，是致病微生物的一些高度保守成分，如脂多糖、肽聚糖、脂蛋白、细菌DNA和病毒双链RNA等[41]。病原体相关分子模式可通过PRR识别刺激信号级联，汇集并激活NF-κB、IFN、激活蛋白1(AP-1)等转录因子，激活的转录因子诱导了多种基因，编码抗菌效应物、细胞因子和趋化因子等，这些基因与诱导免疫反应有关[42-43]。PRR主要有4个亚家族：TLR、NLR、维甲酸诱导基因1样受体和C型凝集素受体，PRR与先天性免疫细胞的结合诱导了适应性免疫细胞的共刺激信号[44-45]。TLR是一类高度保守的PRR，能够识别PAMP从而迅速启动免疫反应来抵抗入侵的病原微生物[46]。TLR4能特异性地识别PAMP，通过跨膜结构将病原相关分子刺激信号转导入细胞内，产生复杂的级联信号反应，激活NF-κB，释放内源性致炎因子TNFα、IL-1、IL-6等，诱导肝细胞坏死和凋亡，趋化中性粒细胞和淋巴细胞浸润，加重肝细胞损伤[47]。NLR基因家族的一些成员，例如NLRP3(由NLRP3、ASC和Caspase-1构成)，参与了“炎症体”大分子蛋白质复合物的组装，这种复合物可激活炎症半胱氨酸蛋白酶Caspase-1切割pro-IL-1β或pro-IL-18，导致这些炎症细胞因子的成熟和分泌[48]。

内源性炎症诱导物是在组织或细胞损伤的情况下产生的，包括坏死细胞释放的分子和细胞外基质分解的产物，这些内源性的炎症诱导因子被称为DAMP[49]。在生理状态下，DAMP分子大多数存在于细胞中并起到维持细胞正常功能的作用；但细胞激活或受损、坏死后，DAMP可从被激活的免疫细胞或坏死细胞、细胞外基质中被释放出来，从而识别危险信号、刺激炎症反应、调节免疫过程等[50-51]。DAMP分子IL-33可协同脂多糖促进TNFα、IL-6、IL-1β等促炎活性，且IL-33的表达增加与HBV-ACLF的严重程度呈正相关[52]。

肝脏炎症可由各种DAMP和PAMP引起，是多种肝病(包括ALF、ACLF、肝硬化、酒精性肝病、肝纤维化和癌症等)免疫病理学的主要组成部分。对乙酰氨基酚致ALF导致肝细胞氧化应激和线粒体损伤，从而释放出可被Kupffer细胞识别的PAMP；反过来，活化的Kupffer细胞又可分泌促炎细胞因子(如TNFα)、活性氧和趋化因子(如CCL2)，放大促炎信号，增加骨髓源性细胞(主要是中性粒细胞和单核细胞)进入肝脏的募集，从而增强炎症过程[53]。高迁移率族蛋白B1(HMGB-1)是最具特征的DAMP之一，在细胞坏死过程中，随着细胞膜完整性的丧失，HMGB-1被释放到局部组织环境和循环中，通过Kupffer细胞上的TLR4和晚期糖基化终产物受体上调NF-κB依赖的促炎细胞因子的分泌[54]。乙酰化HMGB-1可由激活的单核细胞和巨噬细胞分泌，高水平的HMGB-1和乙酰化HMGB-1与ALF患者预后不良相关[55]。

2.2 炎症介质

2.2.1 肿瘤坏死因子α(TNFα) TNFα在肝脏中主要由巨噬细胞(Kupffer细胞)产生，具有免疫调节和促炎活性，既可促使炎症细胞募集、增强活性，从而启动瀑布式炎症级联反应，又可促进肝细胞增殖，在肝再生过程中起着中心作用[56]。在肝衰竭过程中，TNFα是促进还是抑制肝细胞增殖，是拮抗还是加重肝衰竭，这是由发病时期、病情进展程度等决定。在肝损伤早期，高浓度的TNFα可保护肝细胞、促进肝细胞修复和再生；然而，持续增加的TNFα反而会诱导肝细胞的凋亡，加重肝损伤[57]。近年来，“内毒素-巨噬细胞-炎症因子风暴”的肝衰竭发病机制受到了高度重视，而TNFα是由内毒素刺激产生的重要促炎细胞因子。在肝衰竭发生过程中，TNFα可直接损害肝细胞，又可通过促进炎症因子的释放，激活炎症级联反应，从而加重肝细胞坏死；可诱发中性粒细胞向内皮细胞黏附或活化中性粒细胞，促使其趋化聚集于肝脏，释放蛋白酶或氧自由基造成肝细胞损伤；可引起血管内皮细胞损伤，微循环功能紊乱，导致缺血性肝细胞坏死[5]。

2.2.2 白细胞介素1(IL-1) IL-1超家族可分为3部分，包括IL-1亚家族[IL-1α、IL-β、IL-33和IL-1受体拮抗剂(IL-1Ra)]、IL-18亚家族(IL-18和IL-37)及IL-36亚家族(IL-36α、β、γ和IL-38)。上述的所有受体均为杂多聚体，其中至少有1个亚单位是IL-1受体家族的成员，其特征是胞外免疫球蛋白样结构域和胞内Toll/IL-1R(TIR)结构域。细胞刺激后，IL-1R亚单位通过TIR结构域寡聚，随后MyD88与TIR结构域结合，触发NF-κB向细胞核的转移，激活MAPK(如p38和c-Jun氨基末端激酶)，从而导致促炎反应[57]。IL-1Ra可与IL-1R竞争性结合，阻断IL-1引发的信号传递从而起到抗炎作用。有研究[58]表明，IL-1Ra可通过抑制炎症反应,减少肝细胞凋亡,促进肝细胞修复和再生,拮抗肝衰竭。 IL-18能够诱导Th1、NK细胞、NKT细胞等增殖，并具有抗感染、介导炎症反应等多种生物学活性，在先天性和后天性免疫中起着重要的作用。IL-18可促进Th1亚群分化诱导产生大量INFγ、TNFα、FasL和穿孔素等，增强NK细胞和CTL杀伤肝细胞活性，导致肝衰竭[50]。IL-32可促使TNFα、IL-1β、IL-8等炎症介质或趋化因子的释放，介导免疫损伤，加重炎症反应[59]。

综上所述，肝衰竭是临床上常见而严重的临床症候群，其病情进展迅速、预后差、病死率极高。先天性免疫和适应性免疫都参与免疫介导的肝损伤，与肝衰竭的发病机制密切相关。炎症反应是由炎症诱导物→感受细胞→炎症介质→靶组织构成的复杂过程，又与免疫反应密切相关共同参与肝衰竭的发生发展过程。宿主免疫反应与炎症级联反应在肝衰竭发病机制中极为重要，研究其作用机制对于提高临床诊疗水平、研发新药(例如TLR4拮抗剂、肠道失调调节剂、FXR激动剂、TNFα拮抗剂等)有着重要的意义。