N-myc下游调控基因家族在肝细胞癌中的诊断及预后价值

罗 琼， 王春明， 廖航宇， 陈锟灵， 潘明新

1 南方医科大学附属衡阳医院(衡阳市中心医院) 普通外科， 湖南 衡阳 421000；2 南方医科大学珠江医院 肝胆二科， 广州 510282

肝癌是全球癌症死亡的第二大主要原因[1]，仅中国就占病例总数和死亡总数的50%[2]。目前，肝癌尚无合适的预后指标，找到合适的预后指标有利于改善预后和个体化治疗。N-myc下游调控基因(N-myc downstream regulated gene,NDRG)家族由4个成员组成：NDRG1、NDRG2、NDRG3和NDRG4。分子功能涵盖了广泛的生物学过程，包括细胞发育和分化，应激反应和增殖，肿瘤进展和转移[3-4]。NDRG家族与肝细胞癌(HCC)的临床病理特征及其预后之间的关系已有部分报道[5-7]，但结论仍存在争议。因此，本研究通过大数据资料分析了NDRG家族在HCC中的诊断和预后价值。

1 资料和方法

1.1 数据库及网页分析工具 ONCOMINE平台[8]是在线癌症数据库。利用ONCOMINE平台分析NDRG家族在不同癌症的表达谱，并利用Chen Liver和Wurmbach Liver的测序数据，比较这两个测序数据中HCC标本中NDRG家族的mRNA表达与正常对照中的mRNA表达差异。

GEPIA[9]是基于TCGA和GTEx数据的在线分析工具。利用GEPIA分析TCGA数据库中HCC组织和正常肝组织中的NDRG家族的mRNA表达差异，以及HCC不同病理分期中的mRNA表达差异。本研究共收集TCGA数据库中419例HCC组织的基因表达数据分析NDRG家族表达差异，将其分为肝癌组(n=369)和正常肝组织组(n=50)。

Kaplan-Meier Plotter[10]是一个基于GEO、EGA和TCGA数据库的生存分析工具，包含HCC患者的基因表达数据和生存信息。利用该网页生存分析工具分析HCC患者的总生存期(overall survival，OS)，无进展生存期(progression-free survival，PFS)。本研究共收集GEO数据库中364例HCC组织的NDRG家族基因表达数据，分为低表达组[NDRG1(212例)、NDRG2(185例)、NDRG3(182例)、NDRG4(184例)]和高表达组[NDRG1(152例)、NDRG2(179例)、NDRG3(182例)、NDRG4(180例)]。

1.2 统计学方法 采用GraphPad Prism8.2.1进行统计分析。计量资料两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，进一步比较采用Dunnett-t检验采用；生存分析采用log-rank(Mantel-Cox)检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HCC患者NDRG家族的转录水平 利用ONCOMINE数据库比较不同类型癌组织与正常组织中的NDRG家族的转录水平(图1)。对Chen Liver的数据集中197个标本进行测序发现，与正常肝组织相比，HCC中的NDRG1和NDRG3过表达(P值均<0.05)，但NDRG4在HCC组织中的表达低于正常肝组织(P=0.657)(表1)。

对Wurmbach Liver数据集75个标本进行测序发现，与正常肝组织相比，HCC中NDRG2低表达(P=1.000)(表1)。因差异倍数log2FC<2，进一步进行亚组分析。从GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/?acc=GSE6764)中检索Wurmbach Liver的测序数据，分析NDRG2在HCC不同病理分期的转录水平，各分期分别与正常肝组织比较差异均有统计学意义(P值均<0.05)(图2)。

表1 NDRG家族在ChenLiver、Wurmbach数据集HCC组织与正常组织中mRNA转录水平差异

图2WurmbachLiver测序数据中HCC不同临床分期NDRG2mRNA转录水平的差异

2.2 NDRG家族mRNA水平与HCC临床病理特征的关系 利用TCGA数据中的GEPIA工具比较HCC组织和正常肝组织之间NDRG家族的表达水平，结果显示，HCC组织中NDRG1/3的表达水平高于正常肝组织，而NDRG2在HCC组织中的表达水平低于正常肝组织(P值均<0.05)(图3a)。 不同病理分期NDRG1/2/3/4表达差异组间比较差异均有统计学意义(NDRG1:F=3.67,P<0.05;NDRG2:F=2.97,P<0.05;NDRG3:F=5.51,P<0.05;NDRG4:F=3.56,P<0.05)(图3b)。

2.3 生存分析 使用Kaplan-Meier生存分析工具分析TCGA数据库中的364例HCC患者NDRG家族的表达水平对生存影响的差异，结果显示，NDRG1/3高转录组与低转录组相比，OS和PFS均显著缩短(P值均<0.05)。NDRG1高转录组中位OS 37.8个月，中位PFS为13.33个月；低转录组中位OS为70.5个月，中位PFS为29.17个月。NDRG3高转录组中位OS为38.3个月，中位PFS为13.27；低转录组中位OS为71个月，中位PFS为29.77个月。NDRG2低转录组与高转录组相比，OS和PFS均显著缩短(P值均<0.05)。NDRG2高转录组中位OS为81.9个月，中位PFS为29.73个月；低转录组中位OS为38.3个月，中位PFS为13.27个月。NDRG4高低转录组间OS无明显差异(P>0.05)，高转录组与低转录组相比PFS显著延长(P<0.05)。高转录组中位PFS为29.3个月，低转录组PFS为13.03个月(图4)。

注：a，NDRG家族在HCC与正常组织中mRNA转录水平差异(T，肝癌组；N，正常肝组织组)；b，NDRG家族在HCC不同病理分期中的mRNA转录水平差异(StageⅠ:癌细胞高分化;StageⅡ/Ⅲ:癌细胞中度分化;StageⅣ:癌细胞低度分化)。

图3NDRG家族mRNA在不同组织中的转录水平(GEPIA)

3 讨论

NDRG家族基因的失调在许多癌症中都有报道。尽管已经部分证实了NDRG基因在几种癌症的发生和预后中的作用，但尚未对HCC进一步开展生物信息学分析。本研究首次探讨了HCC中NDRG家族的表达对其预后的影响，以期利用大数据基因信息资料提高对HCC患者预后判断的准确性，或为其治疗提供潜在的新靶点。

NDRG1被证实为人类乳腺癌[13-14]、前列腺癌[15]和结肠直肠癌[16]中的抑制基因。关于NDRG1在HCC中的功能存在很多争议。Song等[17]证实NDRG1通过在转录水平上调节ITGB3表达来抑制HCC的增殖和转移。Luo等[5]证实NDRG1是促癌基因。在本研究中，通过分析已有的测序数据发现，NDRG1在HCC组织中的表达高于正常组织，并且与HCC患者的肿瘤病理分期显著相关。这一发现与认为NDRG是促癌基因的结论是一致的。生存分析发现，NDRG1的高表达与OS和PFS显著相关，NDRG1高表达组预后更差。

NDRG2在多种人类癌细胞中有异常表达，包括前列腺癌、甲状腺癌、结直肠癌、食道鳞状细胞癌和胆囊癌[18-22]。既往研究[23-24]发现，NDRG2调节膀胱癌中的细胞增殖和侵袭。Wang等[25]证实NDRG2在HCC组织中显著下调，其表达水平与肿瘤分期相关。一项回顾性研究[26]发现，NDRG2和CD24的联合异常表达与HCC患者的无病生存期(disease-free survival，DFS)和OS相关。本研究发现NDRG2在HCC组织中显著下调，不同病理分期组间比较其表达差异有统计学意义。尽管在Wurmbach Liver测序数据中NDRG2在癌组织与正常组织的表达差异倍数<2，但进一步亚组分析发现不同病理分期的NDRG2表达差异显著。同时，生存分析提示NDRG2的低表达组的OS和PFS更差，表明NDRG2是HCC的抑癌基因。

NDRG3在细胞增殖、分化和其他生物学功能中起重要作用[27]。NDRG3的过表达被认为与非小细胞肺癌、前列腺癌和喉鳞状细胞癌相关[28-30]。Fan等[31]研究提示，miR-122通过靶向NDRG3在HBV相关HCC的发生中起重要作用，认为miR-122和NDRG3可作为HBV相关HCC的诊断标志物和潜在治疗靶标。一项回顾性研究[32]结果显示，NDRG3表达是HCC患者DFS和OS的独立预后指标。在本研究中，NDRG3在HCC组织中的表达高于正常组织。不同病理分期组间比较其表达差异有统计学意义。NDRG3高表达组患者的OS、PFS更差。

目前，对NDRG4的研究相对较少。 NDRG4参与调节人类癌症中的细胞增殖、侵袭、迁移和血管生成[33]。NDRG4在许多肿瘤中的表达均降低，这表明它可能是抑癌基因。Melotte等[34]研究发现，与正常结肠组织相比，NDRG4在大肠癌中的表达降低，NDRG4的过表达可以在体外抑制集落形成以及细胞增殖和侵袭，表明NDRG4是大肠癌的抑癌基因。但是，尚无研究分析NDRG4在HCC中的预后价值，因此需要进一步阐明。

综上，NDRG家族在HCC组织中的差异表达可能对其发生发展中起重要作用。NDRG1/3高表达和NDRG2低表达也可以作为分子标志物来鉴定HCC患者的高危亚组。NDRG1/2/3是HCC的潜在治疗靶标，NDRG1/2/3可以作为HCC预后的一种标志物。