槐榆颗粒质量标准研究

刘明智 ，梁 宏 *，易徐航 ，郝 旭

（1.萍乡市食品药品检验所，江西 萍乡 337000；2.萍乡市中医院，江西 萍乡 337000）

槐榆颗粒是萍乡市中医院应用多年的纯中药制剂，是依据江西名老中医、萍乡市中医院主任中医师王德祖提供的临床经验方研制而成。槐榆颗粒具有清热利湿、活血化瘀、止血镇痛、通利二便等功效，临床应用于痔瘘、肝周皮肤疾病、结肠炎等见上述证候者。槐榆颗粒质量控制所依据的现行标准为《江西省食品药品监督管理局医疗机构制剂》GZJ-0302-（1）-2006，检验项目包括“性状”“鉴别”“检查”，无含量测定项，为了有效控制其质量，保障其临床疗效，该制剂标准亟待提升。槐花是槐榆颗粒处方中的主要饮片，具有清热解毒，凉血止血的药效，常用于治疗血热妄行所引起的各种出血证、肝火上炎之目赤、头痛眩晕等［1］，成分主要包括黄酮类、皂苷类、脂肪酸类、多糖类、挥发性成分等［2］。黄酮类物质芦丁是槐花的主要活性成分，具有降血压、降血脂、抗过敏及抗炎等作用［3］，与槐花功效主治吻合，且在槐花中含量较高，其含量的测定被多次报道［4-5］。本研究采用薄层色谱法分别对槐榆颗粒中槐花、地榆、延胡索进行定性鉴别；同时采用高效液相色谱法测定槐榆颗粒中芦丁的含量，为槐榆颗粒质量标准的提升提供良好的基础与依据。

1 实验材料

1.1 仪器 Agilent1200高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；ME-204型电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；CP225D型电子天平（德国赛多利斯公司）。

1.2 试药 芦丁对照品（批号：100080-201811，HPLC测定含量以91.7%计）、槐花对照药材（批号：121063-201804）、地榆对照药材（批号：121286-201703）、延胡索对照药材（批号：120928-201609），均来源于中国食品药品研究检定院；槐花 （批号：1810006）、秦艽（批号：1811007）、延胡索（批号：1811011），均购自樟树市庆仁中药饮片有限公司；地榆（批号：1808004）、泽泻（批 号：1812012）、防风（炭）（批号：1812010）、当归（批号：1811012）、生地黄（批号：1812012）、黄柏（批号：1810011）、熟大黄（批号：1810004）、桃仁（批号：1812007）、槟榔（批号：181108），均购自江西樟树天齐堂中药饮片有限公司；槐榆颗粒由萍乡市中医院制剂室提供，生产批号分别为：20190802、20190704、20190605、20190504、20190304、20190105；水为超纯水，甲醇、乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 薄层鉴别

2.1.1 槐花的定性鉴别 取本品10 g，研细，加甲醇25 mL，超声处理40 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇3 mL使溶解，作为供试品溶液。另取槐花对照药材0.2 g，加甲醇10 mL，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法［6］进行试验，吸取上述2种溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-水（8∶2∶3）为展开剂，展开，取出，晾干，置碘蒸气中熏数分钟后，日光下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。阴性对照溶液在相应的位置没有斑点，见图1。

2.1.2 地榆的定性鉴别 取本品13 g，研细，加15%（V／V）硫酸溶液 50 mL，振摇后加三氯甲烷 50 mL，回流2 h，放冷，滤过，分取三氯甲烷液并浓缩至约2 mL，作为供试品溶液。另取地榆对照药材5 g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法［6］进行试验，吸取上述两种溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-丙酮-环己烷（3∶3∶4）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以 25%（g／mL）磷钼酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。阴性对照溶液在相应的位置没有斑点，见图2。

2.1.3 延胡索的定性鉴别 取本品9 g，研细，加浓氨水-环己烷（2∶1）30 mL，超声处理 30 min，取上清液，作为供试品溶液。另取延胡索对照药材3 g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法［6］进行试验，吸取上述两种溶液各15 μL，分别点于同一硅胶HF254 薄层板上，以环己烷-三氯甲烷-甲醇（6∶5∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（254 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。阴性对照溶液在相应的位置没有斑点，见图3。

2.2 芦丁的含量测定

2.2.1 色谱条件 Waters symmtery shield Rp18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：以乙腈为流动相A，以1%（V／V）的冰醋酸溶液为流动相B，按表1中的规定进行梯度洗脱；检测波长为257 nm；柱温 25 ℃；流速为 1.0 mL／min；进样量为 10 μL。理论板数按芦丁峰计算均应不低于2 000。

表1 色谱条件梯度洗脱程序

2.2.2 溶液制备

2.2.2.1 对照品溶液的制备 取芦丁对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含50 μg的溶液，即得。

2.2.2.2 供试品溶液的制备 取装量差异项下本品内容物，混匀，研细，取约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定重量，超声处理（功率 250 W，25 kHz）30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，即得。

2.2.2.3 阴性（槐花）对照样品溶液的制备 取地榆 42 g，秦艽 33 g，泽泻 42 g，防风（炭）42 g，当归42 g，延胡索 42 g，生地黄 42 g，黄柏 28 g，熟大黄28 g，桃仁 28 g，槟榔 28 g。共 11味药，加水煎煮2次，第1次煎煮2 h，第2次煎煮1 h，煎液合并，滤过。滤液浓缩至相对密度为1.20～1.25（60℃），加乙醇使含醇量达60%，静置48 h，取上清液回收乙醇，浓缩至相对密度为1.28～1.32（60℃）的浸膏，加入辅料适量，混匀，制成颗粒，干燥，制成100 g。按“2.2.2.2”项下供试品溶液的制备方法制备阴性（缺槐花）对照品样品溶液。

2.2.3 方法学考察

2.2.3.1 系统适用性实验 取对照品溶液、供试品溶液及对照样品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件测定，比较对照品色谱、供试品溶液色谱及对照样品溶液色谱，结果供试品中芦丁色谱峰与杂质色谱峰分离良好，主峰理论踏板数按芦丁计为190 215，见图4。

2.2.3.2 线性关系的考察 精密称取芦丁对照品10.06 mg，精密称定，置于50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品母液。再用相同溶剂分别稀释至浓度为 12.6、25.2、50.3、100.6、201.2 μg／mL的溶液，作为对照品溶液。分别精密吸取上述对照品溶液各10 μL注入液相色谱仪，按“2.2.1”项下色谱条件测定，以峰面积为纵坐标，进样浓度为横坐标进行线性回归，得线性方程Y＝18.675X－2.486 1，r＝0.999 9。 其中 X 为峰面积（mAU·s），Y 为芦丁的浓度（μg／mL）。结果显示芦丁在0.126～2.012 μg之间呈现良好的线性关系。

2.2.3.3 精密度试验 精密吸取对照品（含芦丁50.3 μg／mL），按“2.2.1”项下色谱条件，重复进样6次，结果芦丁峰面积的RSD为0.17%。表明精密度良好。

2.2.3.4 重复性试验 取同一批号（批号20190105）样品共6份，精密称定，按“2.2.2.2”项下供试品溶液的制备方法制备对照品溶液和供试溶液，照“2.2.1”项下色谱条件测定测定芦丁的含量，计算得芦丁含量的RSD为0.20%，表明该方法重现性良好。

2.2.3.5 准确度试验 采用加样回收试验，精密称取已知含量的本品（批号 20190105）约 0.65 g，置具塞锥形瓶中，精密加入“2.2.3.2”项下含芦丁50.3 μg／mL的对照品溶液 10 mL和 60%甲醇 15 mL，按“2.2.1”项下色谱条件测定，计算回收率，结果见表2。

表2 芦丁回收率试验结果（n＝6）

2.2.3.6 稳定性 精密吸取供试品溶液（批号2019 0105），分别在 0、2、4、6、8、12 h 进样，按“2.2.1”项下色谱条件记录芦丁峰面积，结果供试品溶液中芦丁12 h内峰面积无明显变化，芦丁RSD为0.24%（n＝6），表明样品溶液在12 h内稳定。

2.2.3.7 样品测定 取本品6批，照“2.2.1”项下方法试验，测定结果见表3。

表3 样品测定结果

3 讨 论

3.1 高效液相色谱条件的选择 芦丁的结构式中含有羟基，在色谱条件优化过程中发现，以1%（V／V）冰醋酸溶液为水相可有效改善主峰的拖尾因子，且能获得更好的分离度。由于芦丁的保留时间过长，改用梯度洗脱程序，保留时间缩短且峰形得到进一步改善。使用DAD（二极管阵列检测器）进行紫外全波长扫描（190～440 nm）发现，257 nm波长处芦丁有最大吸收，在此波长下主峰有良好的信号响应，基线噪音小。

3.2 提取方法的选择 黄酮类物质一般不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、三氯甲烷等有机溶剂［7］，本文考察了不同浓度的甲醇溶液（20%甲醇、40%甲醇、60%甲醇、80%甲醇、甲醇）和不同超声提取时间（10、20、30、40、60 min）对槐榆颗粒中芦丁提取效果的影响，确定以甲醇为溶剂超声提取（功率250 W，25 kHz）30 min为最优条件。

3.3 槐榆颗粒质量探讨 由“2.2.3.7”项结果得知，不同批次的槐榆颗粒中芦丁含量差异显著，这主要是购进的槐花饮片的质量差异所导致的。制剂的质量势必影响临床疗效，制剂的质量又取决于饮片的质量，中医临证处方历来就讲究中药的道地性，因此中药制剂应将中药饮片的质量控制放在首位。

本研究采用薄层层析法对槐榆颗粒进行定性鉴别，操作简单，重现性好，为槐榆颗粒的质量控制提供了有效的鉴别手段；建立的HPLC法测定槐榆颗粒中芦丁含量方法，经方法学验证，该方法准确、高效，专属性强，重现性好，可用于槐榆颗粒的质量控制，并将为槐榆颗粒标准的进一步提升提供重要的参考。