特克塞尔×哈萨克羊微卫星标记位点多态性与生产性状的关联分析

李彬 李志强 韩冰 比拉力·艾山 张宁 刘明军 贺三刚 依明·苏来曼

摘要：[目的]利用微卫星标记分析特克塞尔×哈萨克羊群体的遗传多样性，并与生产性状进行关联分析，为该品种的遗传育种和性状改良提供分子标记。[方法]选取11个微卫星标记，采用PCR扩增和毛细管电泳技术检测108只特克塞尔×哈萨克羊杂交群体的遗传多样性，并对各位点不同基因型与生产性状进行关联分析。[结果]11个标记位点在该群体中共检测到91个等位基因，平均等位基因数为8.273，平均观测杂合度为0.428，平均期望杂合度为0.815，平均多态信息含量为0.789.关联分析发现如下位点与相应性状之间呈极显著或显著相关：AMEL、ETH152、INRA006和INRAOH3与初生重、断奶重、宰前重和胴体重;CSRD247与胴体长、腿垂直长;INRA005、MAF214和MCM527与腿会斜长、腿耻斜长和踝骨宽;1NRAl72和oARFCB20位点与臀宽、胸宽和肩宽;1NRA063与胸深。[结论]11个微卫星标记位点在该群体中具有较丰富的遗传多态性，且与生产性状均有不同程度的关联性，可以为特克塞尔×哈萨克羊性状改良和育种工作提供分子标记。

关键词：特克塞尔×哈萨克羊，微卫星标记，遗传多样性，生产性状

中图分类号：S813.22文献标志码：A 文章编号：1008-0384（2020）03-0243-11

0引言

[研究意义]特克塞尔羊是肉用羊品种，具有生长速度快、肉品质好、耐粗饲、耐寒及抗病力强等优点;哈萨克羊是肉脂兼用型粗毛羊地方品种，体质结实，蓄积脂肪能力强，抗寒抗病能力强，适应性好。而特克塞尔×哈萨克羊兼具特克塞尔羊与哈萨克羊的优点，其生长速度快，肉品质好，产肉率高。选择与生产性状相关联的微卫星标记位点对特克塞尔×哈萨克羊辅助遗传育种及性状改良有重要意义。（前人研究进展）微卫星标记是共显性标记，在个体间呈高度多态性且数量丰富，被广泛应用于分析物种遗传多样性并作为性状改良的分子标记等研究。王婷、刘泽民等、lbrahimM等、王可等、Kumar等利用微卫星标记分别对四川省6个绵羊群体、大尾寒羊、巴基斯坦绵羊、济宁青山羊、印度山羊等品种进行遗传多态性分析，结果表明群体均具有丰富的遗传多态性。另有研究表明，微卫星标记位点可作为育种和性状改良的分子标记。乌仁套迪等研究筛选出了8个与阿拉善戈壁双峰驼体尺性状相关联的位点，为标记辅助选择提供了依据。马丽娜等通过微卫星标记和滩羊体重性状之间的相关性研究发现12个位点都与体重性状有一定相关性。梁庆玲等用微卫星标记与陶塞特羊生长性状进行相关性分析，发现了与性状相关的标记，为该品种的性状改良提供了參考依据。（本研究切入点）目前，尚未有特克塞尔×哈萨克羊微卫星标记遗传多态性与生产性状间的关联分析相关报道。（拟解决的关键问题）本研究利用11个微卫星标记位点检测特克塞尔×哈萨克羊群体的遗传多样性，并对位点各基因型与初生重、断奶重、宰前重、胴体重、胴体长、腿垂直长、腿会斜长、腿耻斜长、踝骨宽、臀宽、胸宽、肩宽和胸深的关联性进行分析，以期为特克塞尔×哈萨克羊群体的选育提供分子标记。

1 材料与方法

1.1 试验材料及生产指标测定

本试验于新疆畜牧科学院绵羊繁育试验基地，选择9月龄50只公羊和58只母羊共108只体况特征良好、具有一定亲缘关系的特克塞尔×哈萨克羊，采集耳组织样品置于含75%酒精的EP管中，-20℃保存备用。分别在不同时期测定其初生重、断奶重、宰前重及屠宰后的胴体重、胴体长、腿垂直长、腿会斜长、腿耻斜长、踝骨宽、臀宽、胸宽、肩宽和胸深等性状数据。

1.2微卫星标记位点分析

1.2.1 基因组DNA提取 绵羊耳组织样本基因组DNA提取按照QLAGEN公司（德国）的QLAamp 96DNA纯化QLAcube HT专用试剂盒说明书进行提取，1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的完整性，用Nanodrop One超微量分光光度计测定DNA浓度与纯度，将检测合格的样本（OD260nm/OD_280mm值为1.8～2.0）稀释至50ng·uL^-1，一20℃保存备用。

1.2.2微卫星标记选择 选用国际动物遗传协会（ISAG）（https：//www.isag.us）和联合国粮农组织（FAO）（http：//www.fao.org）联合推荐的绵羊遗传多态性较高、扩增效果好的11个微卫星标记位点。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物信息见表1.

1.2.3PCR扩增及基因分型 PCR反应体系为25uL：2×Easy Taq Super Mix 12.5uL，模板DNA l uL，10gmol·L^-1上、下游引物各0.5uL，ddH₂O 10.5ul.PCR扩增程序为：95℃预变性10min;95℃变性40s，最佳退火温度退火30s，72℃延伸60s，共30个循环;72℃延伸10min;4℃保存。PCR产物经2.0%琼脂糖凝胶电泳检测，利用Fragment AnalyzerTM自动化毛细管电泳仪进行基因分型，PROSize 3.0软件读取等位基因结果。

1.3数据统计分析

采用Cervus 3.0软件对样本数据进行分析，统计微卫星标记位点的等位基因数（K）、观测杂合度（Ho）、期望杂合度（He）、多态信息含量（PIC）等数据。选择SPSS 19.0软件中的一般线性模型进行最小二乘方差对微卫星位点不同基因型与生产性状进行相关性分析。一般线性模型为：

Y_ijk=u+G_i+S_j+e_ijk

式中：Y_ijk为个体表型值，u为群体平均值，G_i为个体基因型固定效应，S_j为个体性别效应，e_ijk为随机残差效应。若微卫星位点与性状间具有显著性，应用LSD进行多重比较。以P<0.05表示显著性差异，结果用“均值±标准误”表示。

2 结果与分析

2.1 基因组DNA检测及电泳分型

提取的组织样本DNA经2.0%琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果好的PCR产物后经Fragment Analyzer^TM自动化毛细管电泳仪进行等位基因分型，PROSize3.0软件读取等位基因结果。个体M115在位点AMEL的226/217bp基因型如图1，个体M40在位点ETH152的196/196bp基因型如图2.

2.2 微卫星遗传多样性分析

特克塞尔×哈萨克羊微卫星标记的遗传多态性见表2.结果显示，11对微卫星标记共检测到91个等位基因，平均等位基因为8.273，平均多态信息含量为0.789，平均期望杂合度为0.815，平均观测杂合度为0.428，各微卫星位点PIC>0.5，均表现为高度多态性，表明特克塞尔×哈萨克羊遗传多样性处于较高水平。

2.3 微卫星位点与生产性状关联分析

位点AMEL（表3），DI型个体初生重显著低于CI型（P<0.05），断奶重极显著高于GG和HH型（P<0.01）且显著高于DJ型（P<0.05），宰前重和胴体重极显著高于其他个体（P<0.01），胴体长极显著高于HH型（P<0.01），腿垂直长显著高于GG和HH型（P<0.05），腿会斜长显著高于CI和GG型（P<0.05），腿耻斜长极显著低于HH型（P<0.01），臀宽和肩宽显著高于DJ型（P<0.05）;GG和HH型个体胸深极显著低于DI型（P<0.01）且显著低于CI型（P<0.05）。

位点1NRA023（表4），CH型个体初生重极显著高于BH和CC型（P<0.01）且显著高于EE、EH和GG型（P<0.05），BH型个体初生重显著低于AD和AF型（P<0.05）;AD型个体断奶重极显著高于BH、CC、EE和GG型（P<0.01）且显著高于AF、CH和EH型（P<0.05），宰前重和胴体重极显著高于其他个体（P<0.01），胴体长极显著高于AF型（P<0.01）且显著高于BH、CC、EE、EH和GG型（P<0.05），腿垂直长显著高于AF、BH、CC和EE型（P<0.05），踝骨宽显著高于AF、CC、CH、EE和EH型（P<0.05），臀宽显著高于BH、CC、EE和GG型（P<0.05），胸宽极显著高于BH、EE、EH和GG型（P<0.01）且显著高于AF和CC型（P<0.05），肩宽显著高于EE型（P<0.05）。在腿会斜长性状上，AD和GG型个体显著高于BH、CC和EE型（P<0.05）。

位点INRAl72（表5），BB型个体断奶重、宰前重和腿会斜长显著高于GG型（P<0.05），胴体重显著高于FF和GG型（P<0.05），腿耻斜长显著高于DD型（P<0.05）;GG型个体臀宽显著低于AA和DD型（P<0.05），胸宽显著低于AA型（P<0.05），肩宽显著低于AA和BB型（P<0.05）。

位点CSRD247（表6），AF型个体胴体长显著高于EE型（P<0.05）;BF型个体腿垂直长显著高于EE和FF型（P<0.05）;FJ型个体踝骨宽极显著低于AF和EE（P<0.01）且显著低于BF和FF型（P<0.05）。

位点ETH152（表7），AC型个体断奶重显著高于DD型（P<0.05）;CC型个体胴体重显著高于EE型（P<0.05）;AE型个体腿耻斜长显著低于CC和EE型（P<0.05）;在踝骨宽性状上，AC型个体极显著高于BB和EE型（P<0.01）且显著高于CE和DD型（P<0.05），AE型个体显著高于BB和EE型（P<0.05）;AE型个体胸宽显著高于EE型（P<0.05）。

位点INRA005（表8），AE型个体胴体长显著高于AH（P<0.05）;DH型个体腿会斜长显著高于AE和BB型（P<0.05），腿耻斜长极显著高于BB型（P<0.01）且显著高于AE、AF和HH型;在踝骨宽性状上，AE型个体极显著高于PP和HH型（P<0.01），FF型个体显著低于AA和BB型（P<0.05）;AH型个体胸宽显著低于AA、AE、AF和FF型（P<0.05）。

位点INRA006（表9），AG型个体初生重极显著高于BB和CC型（P<0.01）且显著高于AA和FF型（P<0.05）;AC型个体断奶重显著高于BB型（P<0.05），胸宽极显著高于BB型（P<0.01）且显著高于AA、CC和FF型（P<0.05）;AC和AG型個体宰前重和胴体重显著高于AA、BB和CC型（P<0.05）。

位点INRA063（表10），EF型个体初生重显著高于BB型（P<0.05）;EE型个体腿会斜长显著低于BB、DD和DG型（P<0.05）;在腿耻斜长性状上，DG型个体极显著高于BB型（P<0.01）且显著高于CC和EE型（P<0.05），DD型个体显著高于BB型（P<0.05）;DG型个体臀宽显著高于CC、EE和HH型（P<0.05）;EF型个体胸宽显著高于HH型（P<0.05）;BB型个体胸深型显著高于EE型（P<0.05）。

位点MAF214（表11），DH型个体断奶重显著高于BB型（P<0.05）;BI型个体宰前重和胴体重显著高于BB型（P<0.05）;CG型个体腿垂直长显著高于BB、BI和CC型（P<0.05）;CG型个体腿耻斜长极显著低于BB、BI和CC型（P<0.01）且显著低于AA型（P<0.05）;在踝骨宽性状上，BI型个体极显著高于CG型（P<0.01）;AA型个体臀宽显著高于BB型（P<0.05）;CG型个体肩宽显著高于BB型（P<0.05）。

位点MCM527（表12），在断奶重性状上，BB型个体显著高于AA和AE型（P<0.05），BE型个体显著高于AA型（P<0.05）;BB和BE型个体宰前重极显著高于EE型（P<0.01）且显著高于CE型（P<0.05），胴体重显著高于AE和EE型（P<0.05）;AA型个体腿耻斜长显著高于AE型（P<0.05）;BE型个体腿会斜长显著低于BB型（P<0.05），踝骨宽极显著高于AA、CC和EE型（P<0.01）且显著高于AE、CE和DD型（P<0.05），胸宽显著高于CC、CE和EE型（P<0.05）;BB型个体肩宽显著高于EE型（P<0.05）。

位点OARFCB20（表13），BI型个体断奶重极显著高于CG和GG型（P<0.01）且显著高于BB、DD、EI和Ⅱ型（P<0.05），宰前重显著高于DD和GG型（P<0.05），胴体重显著高于DD、EI和GG型（P<0.05），腿耻斜长极显著低于GG型（P<0.01），臀宽显著高于DD和EI型（P<0.05），胸宽极显著高于DD型（P<0.01）且显著高于BB、EI和GG型（P<0.05），肩宽极显著高于DD型（P<0.01）且显著高于EI和GG型（P<0.05），胸深显著高于BB、DD和EI型（P<0.05）。

3 讨论

3.1 微卫星标记遗传多样性

微卫星标记的遗传多样性既可以反映群体的遗传变异情况，也可为后期的遗传育种、品种改良提供有力依据。Barker等研究表明微卫星位点的等位基因数≥4时才可利用遗传参数评估多样性。多态信息含量（PIC）是检测基因多态态性的指标。Botstcin等研究表明当PIC>0.5时，群体具有高度多态性。本研究所选择的11个微卫星位点等位基因均大于4个，平均等位基因数8.273.FaridA等用10个微卫星标记对10个品种共257只绵羊的遗传变异性进行了评估，平均每个位点的等位基因数均大于4个。VajedEMT测定伊朗14个绵羊品种的5个微卫星标记的遗传多态性，PIC均大于0.5.周明亮等利用微卫星标记研究布拖黑绵羊群体的遗传特性，PIC平均为0.6257，显示布拖黑绵羊群体具有丰富的遗传多样性。张瑞等用24对微卫星分析岷县黑裘皮羊群体内遗传多样性，平均多态信息含量为0.6527，结果表明，岷县黑裘皮羊群体内遗传多样性丰富，可为选育保种等工作提供理论依据。本研究所选取的11个微卫星标记位点均是高度多态性位点，PIC为0.789，说明该11个微卫星位点适用于特克塞尔×哈萨克羊群体的遗传多样性的正确评估及与生产性状的关联分析。

3.2 微卫星标记与生产性状关联性

微卫星标记与生产性状的关联性研究在动物分子标记辅助育种中已被广泛应用。关联分析是利用基因间的连锁不平衡，对基因型和表型数据的差异分析存在的相关性，因此可以利用微卫星标记进行分析，确定相关联的基因型。迟浩斌等对早胜牛微卫星位点研究发现D12S4位点基因型与初生重和6月龄重、D15S10和D19S2位点与体高和体长性状均存在关联效应。王斌等研究结果表明BM2113、ETH225、ILSTS005和BMl824位点均与宣汉牛的体高和体长性状有关联性。德吉等对340只西藏绒山羊的10个微卫星位点的多态性与经济性状进行关联分析，发现BMSl246和BM3033位点与体高性状有相关性。李标等用29个高多态性微卫星标记对宁夏盐池滩羊的体重和体尺数据关联分析，结果显示MAF33与体高和胸深显著相关。张瑞等对岷县黑裘皮羊遗传多态性与生产性状关联分析，结果显示OarFCB304和MAF70位点与體重;ILSTS28位点与胸宽;OarFCB304、OarJMP29和MAF209位点与胸深等性状显著性相关。

本研究选择的11个微卫星位点与特克塞尔×哈萨克羊生产性状均具有一定的相关性，其中与初生重、断奶重、宰前重、胴体重相关的位点有9个：AMEL、ETHl52、INRA006、INRA023、INRA063、INRAl72、MAF214、MCM527和OARFCB20;与胴体长、腿垂直长、腿会斜长、腿耻斜长相关的位点有10个：AMEL、CSRD247、ETHl52、1NRA005、INRA023、INRA063、INRAl72、MAF214、MCM527和OARFCB20;与踝骨宽、臀宽、胸宽、肩宽和胸深相关的位点有11个：AMEL、CSRD247、ETHl52、INRA005、INRA006、INRA023、INRA063、INRAl72、MAF214、MCM527和OARFCB20.由于样品量有限，本研究得到的结果尚需大群体样本的进一步验证。