木姜子挥发油与β-环糊精包合工艺的优化*

徐思鑫，乔婷宜，张 露，张跃欢，陈 青

(贵州大学化学与化工学院化学系，贵州 贵阳 550025)

木姜子(LitseapungensHemsl)为樟科木姜子属植物，我国有72种，主要分布于广东、广西、福建、浙江、江苏、广西、湖南、湖北、四川、云南、贵州等地，迄今仍以野生为主[1]。木姜子干果具有独特香味，在中药业界被称为“毕澄茄”，可应用于吸血虫病的治疗，效果良好[2]。木姜子在贵州资源丰富，是贵州苗族常用的传统中药材，用于治疗疮毒、风寒湿痛、胃寒腹泻、跌打肿痛等症[3]。此外，因其独特的味道，也作为调味料在苗族食品中使用。木姜子属植物含有挥发油、甾体、生物碱、脂肪酸和黄酮等多种化学成分[4]，具有抗炎、杀菌、抗病毒及杀虫等生物活性。

据文献报道，木姜子果实富含挥发油，柠檬醛、柠檬烯、α-蒎烯、β-蒎烯、β-月桂烯等单帖是其主要化学成分[5]。萜类化合物具有多种生物活性，如柠檬醛可用于配制食用香料、合成紫罗兰酮[6]；柠檬烯具有抗癌、止咳平喘等生理活性[7]；α-蒎烯有着显著的抗菌、镇咳祛痰作用[8]；β-月桂烯是有机反应中重要的原料；β-蒎烯可用于合成紫苏醇、紫苏亭等[9]。木姜子挥发油在合成香料、食品工业及医学领域都有很好的应用前景。但是木姜子挥发油在常温下易挥发，性质不稳定，实际应用时采用一般制剂方法难以对其进行有效的控制。鉴于此，论文选用贵州木姜子新鲜果实为原料，通过水蒸气蒸馏法提取挥发油，进行木姜子挥发油与β-环糊精包合物的制备，利用星点设计-响应面法对其包合工艺进行优化，并对包合物进行表征，为木姜子挥发油的进一步开发利用提供理论依据。

1 实 验

1.1 实验仪器

场发射扫描电镜，FEI公司；FZ102微型植物式样粉碎机，北京市永光明医疗仪器厂；STA449C差热分析仪，日本岛津；Vertex-70傅里叶变换红外光谱仪，日本岛津；WFE UV-2000型紫外可见分光光度计，尤尼柯仪器有限公司；RE52C 型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；TP-114电子分析天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司；ZK-82B型真空干燥箱，上海实验厂股份有限公司。

1.2 实验试剂

木姜子新鲜果实，2018年6月于贵州省贵阳市地区采集。由贵阳中医大学陈德媛教授鉴定为木姜子属(Litseapungens)植物木姜子(LitseapungensHemsl)地上部分。

所用试剂无水硫酸钠，无水乙醇，β-环糊精，二甲基亚砜等均为分析纯。

1.3 实验方法

1.3.1 水蒸气蒸馏法提取木姜子挥发油

将250 g新鲜木姜子果实粉碎，装入5000 mL圆底烧瓶，加入3000 mL蒸馏水，于100 ℃加热回流提取挥发油。待挥发油冷却至室温后，使用无水硫酸钠进行干燥过滤。得到浅黄色透明油状的木姜子挥发油，得油率为1.29%。将挥发油装满，塞紧放入玻璃瓶，低温保存，备用。用比重瓶法[10]测得木姜子挥发油平均密度为0.8567 g/mL。

1.3.2 木姜子挥发油β-环糊精包合物制备

分别称取4 g、5 g、6 g、7 g、8 g、9 g的β-环糊精于500 mL圆底烧瓶中，加入200 mL蒸馏水，微热搅拌制得环糊精饱和水溶液；将环糊精饱和水溶液加热至40 ℃，磁力搅拌下缓慢加入1 mL木姜子挥发油，进行反应，2 h后，取出反应物自然冷却到室温。反应物在冰箱中冷藏二天，抽滤得到滤饼，无水乙醇少量洗涤滤饼3～4次后，滤饼放入真空干燥箱(40 ℃)中干燥2天后得到产品，产品呈白色粉末状。

将包合物置于索氏提取器中，用水回流提取包合物中的木姜子挥发油，计算包合物的包合率。以包合物的含油率Y1、收得率Y2及包封率Y3作为包合物的评价指标，归一值(OD)作为综合评价指标，得到各因素最佳值，为星点设计作参考。Y1、Y2、Y3及OD的计算公式如下：

含油率Y1=包合物中木姜子挥发油的质量/包合物质量×100%

收得率Y2=包合物质量/(木姜子挥发油加入量+环糊精加入量)×100%

包封率Y3=木姜子挥发油回收量/(空白回收率×木姜子挥发油加入量)×100%

空白回收率=木姜子挥发油回收量(mL)/木姜子挥发油加入量(mL)×100%

OD=Y1/Y1max×0.2+Y2/Y2max×0.4+Y3/Y3max×0.4

1.3.3 单因素实验

选取木姜子挥发油与β-环糊精的投料比(mL:g)(1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9)、包合温度(30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃)以及包合时间(1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h)为单因素实验因素。并以包合物含油率Y1、包合物收得率Y2和挥发油包封率Y3作为评价包合物的指标，归一值(OD)作为评价包合物的综合指标，确定投料比、包合温度及包合时间的最优值，以最优值作为后续星点设计实验的依据。

1.3.4 星点实验设计

在单因素实验基础上，以含油率Y1、收得率Y2及包封率Y3作为包合物的评价指标，归一值(OD)为综合评价指标。通过星点设计原理对投料比(A)、包合时间(B)及包合温度(C)三个因素分别设置5个水平，并采用-α，-1，0，+1，+α表示(α=1.682)，根据单因素试验结果，来选择投料比、包合时间和包合温度的中心点的取值。

1.3.5 木姜子挥发油β-环糊精包合物表征

(1)UV分析

以β-环糊精、木姜子挥发油、挥发油包合物及挥发油物理混合物为测试样品，分别用二甲基亚砜配制成0.1 mg·mL-1的溶液，后进行紫外可见光光谱分析，扫描波长范围为200～800 nm，每个样品平行测定3次，后使用软件Origin对测定数据进行紫外分析处理。

(2)IR分析

以β-环糊精、挥发油包合物及挥发油物理混合物为测试样品，采用溴化钾压片法进行实验处理，挥发油样品采用溴化钾涂片法进行实验处理；扫描波数范围为4000～400 cm-1，进行红外光谱分析，每个样品均平行测定3次[11]。后使用软件Origin对测定数据进行红外分析处理。

(3)TG分析

准确称取β-环糊精及木姜子挥发油包合物5 mg(精确至0.001 mg)样品于坩埚中，氮气速率为50 mL/min，加热温度范围为30～800 ℃，升温速率为10 ℃/min，测定样品热分解曲线[11]。后使用软件STARe V13.0对测定数据进行热重分析处理。

(4)SEM分析

将待观察的β-环糊精及木姜子挥发油包合物通过无水乙醇涂布于载玻片胶上，待分散剂挥发干燥，喷金后分别在1000倍与4000倍的条件下进行扫描电子显微镜下观察。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验结果

2.1.1 投料比对包合工艺的影响

图1 投料比对包合工艺的影响Fig.1 Influence of feeding ratio on encapsulation process

由图1可知，随着投料比增加，OD值增加。当投料比增至1:6时，OD值达到最大值，此后随着投料比的增加，OD值开始下降。推测投料比为1:6时，β-环糊精对木姜子挥发油的包合量达到饱合，β-环糊精利用率达到最大，使得综合指标OD值达到最大。因而选择木姜子挥发油与β-环糊精最优投料比为1:6(mL:g)。

2.1.2 时间对包合工艺的影响

由图2可知，随着包合时间延长，OD值也随之增加。在包合时间达4 h时，OD值最大，继续延长包合时间，OD值开始下降。包合反应为可逆反应，推测在包合过程中，开始时包合速度大于包解速度，故OD值不断增加。当包合4 h后，包合过程与解包过程趋于动态平衡，OD值达到最大。此后继续反应，部分包合物发生解络，使得OD值下降。因而选择最佳包合时间为4 h。

图2 包合时间对包合工艺的影响Fig.2 Influence of encapsulation time on encapsulation process

2.1.3 温度对包合工艺的影响

由图3可知，随着包合温度升高，OD值随之增大，温度达到50 ℃时，OD值最大，此后增加包合温度，OD值开始减小。包合反应为放热反应[12]，当达到反应平衡后，继续加热不利于包合反应的进行，使得OD值下降。因此选择最佳包合温度为50 ℃。

图3 包合温度对包合工艺的影响Fig.3 Influence of encapsulation temperature on encapsulation process

2.2 星点实验设计结果

根据单因素实验的结果，挥发油和环糊精投料比、包合时间及包合温度中心点取值分别为1:6(mL:g)、4 h、50 ℃。实际值与编码值如表1所示，星点实验中包合物的制备依据实验1.3.3方法进行。

表1 星点实验设计结果Table 1 Design results of star-point experiment

2.3 模型拟合及方差分析

表1数据通过软件Design-Expert 8.05进行数据处理后，得到含油率Y1、收得率Y2以及包封率Y3对投料比A、包合时间B和包合温度C的多元线性回归方程和二次多项式拟合，后对二次多项式拟合方程中各项系数分别进行方差分析，方差分析结果如表2所示。

多元线性回归方程：

Y1=8.85-0.83A+0.31B+0.06C P=0.0009 r=0.6327

Y2=86.17-0.44A-1.63B+0.49C P=0.4300 r=0.1542

Y3=61.68+2.65A+0.90B+0.77C P=0.3121 r=0.1947

OD=54.23-0.65A+0.52B+0.13C P=0.9070 r=0.0330

二次多项拟合：

Y1=9.45-0.83A+0.31B+0.07C-0.20AB-0.09AC-0.37BC-0.16A2-0.36B2-0.36C2

P=0.0001 r=0.9284

Y2=88.93-2.71A-1.84B+0.56C+0.25AB-0.49AC+1.88BC-2.76A2-0.21B2-1.07C2+0.80ABC+0.35A2B-0.11A2C+3.88AB2

P=0.0780 r=0.6989

Y3=68.66+2.65A+0.90B+0.77C-3.95A2-2.86B2-3.40C2

P=0.0029 r=0.8611

OD=59.49-0.65A+0.52B+0.13C+0.38AB+0.28AC-0.34BC-2.69A2-2.35B2-2.66C2

P=< 0.0001 r=0.9556

上述回归方程的拟合效果，可以通过拟合方程的复相关系数r值与P值来判定。根据二次多项式拟合中的复相关数P值以及r值来看，选取的三个自变量与三个评价指标以及综合指标OD值的线性拟合相关性大，并且拟合程度高，预测性好，故二次多项式拟合的效果较好。同时从实验结果来看，3个实验考察因素对实验考察指标都有影响，影响综合指标OD值的顺序是A>B>C，其复相关系数P<0.0001，r=0.9556，拟合程度较高，因而可作为分析预测模型。

从表2方差分析结果可以看出，二次多项式拟合模型是一个极显著的模型(F=23.91，P<0.0001)；交互项都不显著，但二次项A2，B2，C2的影响极显著，由此表明实验各个因素之间的交互作用较小，则该二次多项式拟合效果较好，并且具有极显著性，因而该模型可作为木姜子挥发油β-环糊精包合工艺的分析预测模型[13-16]。

表2 方差分析结果Table 2 Results of variance analysis

注：p<0.001为极显著；p<0.05为差异性显著。

2.4 响应面图分析

使用Design-Expert 8.05软件绘制考察指标与考察因素的三维曲面图以及等高线图。

图4 投料比与包合时间对OD值的三维曲目图及等高线图Fig.4 3d track chart and contour map of OD normalized by feeding ratio and inclusion time

图5 包合温度与包合时间对OD值的三维曲面图及等高线图Fig.5 3d surface diagram and contour diagram of OD normalized by inclusion temperature and inclusion time

图6 投料比与包合温度对OD值的三维曲面图及等高线图Fig.6 3d surface diagram and contour diagram of feeding ratio and inclusion temperature normalized OD

从响应面图及等高线图可以看出木姜子挥发油与β-环糊精的投料比、包合时间及包合温度对OD值有显著的影响，运用软件Design-Expert 8.05对等高线图进行分析，可得实验优化条件为木姜子挥发油与β-环糊精投料比1:5.77(mL:g)，包合时间4.09 h(245.4 min)，包合温度51.5 ℃。

2.5 工艺优化结果和验证

按照实验优化条件：木姜子挥发油与β-环糊精投料比1:5.77(mL:g)，包合时间4.09 h(245.4 min)，包合温度51.5 ℃，进行3次验证实验，采用含油率Y1、收得率Y2以及包封率Y3三个评价指标来验证实验优化结果的可信度。

表3 验证实验结果Table 3 Verification of test results

偏差=(预测值-实际值)/预测值×100%

实验验证结果如表3所示，实验的含油率Y1、收得率Y2和包封率Y3与其预测值的偏差值分别为-0.31%、1.04%、-1.05%，两者相近，说明优化工艺参数可信度高。

2.6 包合物表征结果

2.6.1 UV分析

木姜子挥发油、木姜子挥发油包合物和物理混合物紫外吸收光谱图如图7所示。

从图7可知，在250～410 nm波长范围内，β-环糊精无吸收。在254 nm波长处，木姜子挥发油出现最大吸收峰，由于木姜子挥发油中含有醛酮类化合物，则判断该吸收峰是由n→π*跃迁所产生的吸收带。物理混合物也在255 nm处出现最大吸收峰，其与木姜子挥发油的紫外吸收基本相同，但最大吸收波长略有差别。包合物在259 nm处出现吸收峰，但吸收强度减弱，这可能是因为通过氢键作用，木姜子挥发油和β-环糊精形成了包合物后，木姜子挥发油本身的共轭体系受到破坏，使得包合物的吸收峰出现紫移，则吸收强度减弱。

图7 紫外吸收光谱图Fig.7 UV absorption spectra

2.6.2 IR分析

β-环糊精、木姜子挥发油包合物、物理混合物、木姜子挥发油红外光谱图如图8所示。

图8 红外光谱图Fig.8 Infrared spectrogram

由图8可知，在3700～3000 cm-1范围内，物理混合物与β-环糊精均有着很强的吸收峰，这可能是因为β-环糊精分子中的OH官能团比较多，由于这些OH伸缩振动，从而引起了吸收峰。在1030 cm-1处，其也具有很强的吸收峰，这是由于β-环糊精分子中存在-CH2-O-CH2-，其伸缩振动而引起了吸收峰。在1820～922 cm-1处，由于-C=O伸缩振动，木姜子挥发油具有特征吸收峰，由于木姜子挥发油中主要含有醛酮类化合物和萜类化合物，则在1377 cm-1处存在-CH3吸收峰和在1143 cm-1处存在=CH2吸收峰。包合物中，由于-C=O伸缩振动，使得其吸收频率向低波数方向移动，其波数为1673 cm-1；且各吸收峰相较于挥发油的吸收峰均出现了明显的减弱，这可能是由于主客体间有非共价键的弱作用力产生，使得发色团的振动减弱，可证明木姜子挥发油分子藏进β-环糊精分子的空腔内，形成了包合物。

2.6.3 TG分析

木姜子挥发油包合物与β-环糊精的TG的热降解曲线见图9。

图9 β-CD、包合物TG图和DTA图Fig.9 β-CD, inclusion TG diagram and DTA diagram

由图9可以看出，木姜子挥发油包合物与β-环糊精的热重曲线可分为三个阶段。木姜子挥发油包合物：第一阶段物质质量损失了2%，温度范围是38～334 ℃；这个阶段主要是由于除去样品表面结合水分和样品内存在的水分以及分解小分子碳氢化合物从而造成了损失；第二阶段的温度范围为334～380 ℃，此过程主要是木姜子挥发油包合物的解聚和分解过程，总的质量损失为 29%；第三阶段对应的温度范围为380～700 ℃，其可能是中间产物的完全分解，这一阶段的平均降解速率和总重量的损失均低于第二阶段，在700 ℃处便基本完成了样品的热分解。而β-环糊精：第一阶段的温度范围为38～385 ℃，质量损失了10%，与木姜子挥发油包合物的状况相同，这个阶段其也是由于除去样品表面结合水分和样品内存在的水分以及分解小分子碳氢化合物的而造成了损失；第二阶段的温度范围为385～517 ℃，此过程主要是β-环糊精解聚和分解过程，其起始分解温度大于木姜子挥发油包合物，表明药物分子通过β-环糊精的包合，其热分解稳定性得到了提高，这可能是由于β-环糊精和木姜子挥发油包合后，改变了β-环糊精的晶体类型所致。第三阶段对应温度范围为517～700 ℃，中间产物完全分解，其平均降解速率和总重量损失均低于第二阶段。

此外，由图9还可以看出，第二阶段的木姜子挥发油包合物的质量损失远大于对应的β-环糊精；β-环糊精的最快反应速率相对应的温度要高于对应的木姜子挥发油包合物；在800 ℃时，其剩余的质量主要是灰分。木姜子挥发油与β-环糊精形成的包合物的灰分含量大于β-环糊精。

2.6.4 SEM分析

β-CD和木姜子挥发油包合物的SEM结果如图10所示。

图10 β-环糊精与环糊精包合物电镜扫描图Fig.10 Scanning electron micrograph of the inclusion of n-cyclodextrin and cyclodextrin

由图10中的电镜图(a)和(c)可以看出，β-环糊精的结构为无规则分散的片状结构，有比较明显的团聚现象，这是由于β-环糊精分子中含有较多的-OH官能团，分子之间氢键等作用明显，从而引起分子团聚。而环糊精包合物相对纯环糊精尺寸较小且分布均匀，这是由于木姜子挥发油和β-环糊精形成包合物后，环糊精分子间的相互作用遭到破坏，因而能够得到比较规整的小尺寸粒子；同时从电镜图10(b)和(d)可以看出，β-环糊精与木姜子挥发油形成包合物后，物质的结构从无规则片层结构变成了单斜立方体的晶体结构，这与文献报道的结果一致[17]。

3 结 论

通过单因素实验及星点设计-响应面实验确定木姜子挥发油β-环糊精包合物的最佳制备工艺条件为：木姜子挥发油与β-环糊精投料比为1:5.77(mL:g)，包合时间为4.09 h(245.4 min)，包合温度为51.5 ℃。通过三次验证实验得到的含油率Y1、收得率Y2及包封率Y3与其预测值相近，证明优化工艺参数可信度高，重复性良好。木姜子挥发油β-环糊精包合物通过饱和水溶液法制备，其仪器简单且操作方便；将挥发油制备成环糊精包合物后，由于挥发油环糊精包合物是固体则有利于保存挥发油，也可以增加药物溶解性、生物利用度并提高制剂的稳定性。木姜子挥发油包合物则能够克服挥发油本身在应用上的缺陷，为挥发油的实际应用提供可靠的理论参考。