SWE评估针刀松解法对膝骨关节炎模型兔MCL、LCL弹性模量的影响*

王春久，王 彤，杨 雪，舒 琦，郭长青

(北京中医药大学，北京 100029)

膝骨关节炎(Knee osteoarthritis,KOA)是引起全球2.5亿人关节紊乱的常见原因。中国膝骨关节炎的发病率高达18%，女性较男性更易患KOA[1-2]。关节力学失稳是KOA发病机制中的重要一环。韧带作为力的承受和传递组织，主要参与维持膝关节稳定的静力性系统。有学者证实在KOA动物模型中韧带的力学性能改变可造成骨关节应力变化，最终导致软骨基质的退变[3-5]。韧带具有粘弹性，其刚度越高关节稳定性越大，研究表明运用剪切波超声弹性成像技术(SWE技术)测量肌肉韧带的弹性模量，能够客观评估其刚度等力学特性的变化，韧带损伤后其超声弹性模量值下降[6-7]。KOA发病时屈、伸肌群肌力均会下降，且女性的屈肌肌力下降幅度最大，与造成KOA的关节疼痛密切相关[8-9]。课题组前期研究发现KOA模型兔伸肌肌力显著下降，针刀干预伸肌后能有效改善肌肉、韧带的力学性能，缓解软骨基质退变[3,10-11]，而目前以屈肌为干预手段的实验研究较少。故本实验运用SWE技术评估KOA兔内侧副韧带(Medial collate-ral ligament，MCL)及外侧副韧带(Lateral collateral ligament，LCL)的超声弹性模量，观察针刀松解屈肌后对MCL、LCL力学性能的影响，为针刀治疗KOA的力学效应提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物与分组

SPF级6月龄新西兰雄兔28只，购于北京科宇动物养殖中心，许可证号：SCXK(京)2018-0010，体质量(3.0±0.5)kg。单笼、标准饲料饲养，自由摄食、水，室温(22±2)℃，湿度40%～60%，定期紫外线消毒。采用随机数字表法分为正常组、模型组、针刀组、电针组共4组，每组7只，6只用于指标检测，1只用于验证造模。研究过程遵循中华人民共和国科技部颁发的《关于善待实验动物的指导意见》。

1.2 主要试剂与仪器

1.2.1 试剂与材料 戊巴比妥钠(天津药业焦作有限公司)；酒精(北京民生药业有限公司)；4%多聚甲醛、苏木素伊红试剂、石蜡(北京化学试剂公司)；二甲苯(北京北化化学品有限责任公司);固宝牌树脂绷带(规格:15 cm×180 cm,珠海丽珠医用生物材料有限公司)；高分子绷带(规格:7.5 cm×360 cm,苏州可耐特医疗科技有限公司)；一次性汉章系列超微针刀(规格:0.35 mm×25 mm,北京卓越华友医疗器械有限公司)；一次性环球牌针灸针(规格:0.2 mm×13 mm,苏州针灸用品有限公司)。

1.2.2 主要仪器 LH202H型韩式穴位神经刺激仪(北京华为产业开发公司)；EG1150型分体式包埋机(LYCRA)；半自动轮转式切片机RM2245型(LYCRA)；Tissue-TEK VIP6生物组织脱水机(日本樱花株式会社有限公司);HI1210型Leica捞片仪(LYCRA)；HI1220型烤片仪(LYCRA)；BX53型自动化智能型正置研究级显微镜(Olympus Corporation)； AixPlorer实时剪切波弹性成像超声诊断仪(法国声科影像公司);线阵探头L10-2 mHz。

1.3 模型制备

采用改良Videman法固定制备KOA模型：造模前禁食10～16 h，3%戊巴比妥钠以30 mg/kg剂量耳缘静脉麻醉，起效后仰卧位固定于兔台，树脂绷带于(75±10)℃热水中浸泡软化，牵拉伸直兔左后肢，脱脂棉垫于树脂绷带内层，从腹股沟处用软化后的树脂绷带固定至足趾，确保膝关节固定在180°、踝关节背屈60°位置，随后以医用纱布包绕树脂绷带，再外缠2层高分子绷带，最外层以防啃咬绷带包裹。模型组、针刀组、电针组3组均按上述方法造模，制动8周。8周后，随机抽取正常组、模型组各1只兔，处死后取左后肢关节软骨用HE光镜观察造模情况，成功后再拆除各组制动材料。

1.4 各组干预措施

1.4.1 正常组 正常饲养，不做干预，抓取、捆绑固定同干预组。

1.4.2 模型组 造模后正常饲养，不做干预，抓取、捆绑固定同干预组。

1.4.3 针刀组 制动解除1周后，每周治疗1次，干预3周。在左后肢膝周针刀干预部位，龙胆紫定点，备皮消毒后，按针刀4步进针规程刺入进行松解，出针后按压片刻止血。进针点具体针刀操作：①半腱肌、半膜肌、股二头肌肌腱止点针刀操作：松解肌腱移行处，术者左手拇指用力按压，将软组织紧紧按压在骨面上，针刀刀刃平行于肌腱，刀体垂直皮肤切面刺入，向肌腱与骨连接方向松解3～5刀;②条索结节点：在膝周进行循按触摸，术者左手拇指按压明显的条索结节点，刀刃平行于条索结节纵轴，刀体垂直皮肤切面刺入，向条索结节的纵轴方向松解3～5刀。

1.4.4 电针组 制动解除1周后，隔天治疗1次，干预3周。取穴参照《实验针灸学》《动物比较生理学》，并结合比较解剖取穴法、模拟骨度取穴法，电针左后肢“曲泉”“委阳”“内膝眼”“外膝眼”腧穴，常规备皮、消毒，以毫针刺入上述穴位后，再以韩氏穴位神经刺激仪分别连接“曲泉”“委阳”“内膝眼”“外膝眼”，选用频率2/100 Hz、疏密波型，强度3 mA，留针20 min。

1.5 观察指标与检测方法

1.5.1 软骨HE染色光镜观察 造模完成后，随机抽取正常组、模型组各1只兔，处死后取左后肢关节软骨标本，用生理盐水冲洗后浸入4%多聚甲醛溶液，固定72 h。固定后浸入EDTA脱钙液进行脱钙，然后脱水、透明、脱蜡、石蜡包埋，切片厚度6 μm，苏木素-伊红染色后，对兔膝关节软骨情况进行形态学观察。

1.5.2 SWE检测MCL、LCL的超声弹性模量 治疗结束1周后对各组兔进行SWE检测，采用法国声科影像 AixPlorer型实时SWE超声诊断仪对各组兔内、外侧副韧带行在体弹性模量测量。检测前备皮左后肢，备皮范围由腹股沟至足踝，取仰卧位固定其余三肢于兔台上，使左后肢处于最大伸直位，待兔安静后检测MCL、LCL的超声弹性模量。首先探头横、纵切面探查MCL、LCL，进行常规二维超声检查，纵轴切面内选定感兴趣区(ROI)，切换SWE模式，组织受声辐射脉冲(Sonic Touch)刺激，超高速成像技术(UltraFAST)探测Sonic Touch产生的剪切波，形成组织弹性图；冻结图像，用Q-BOX功能测量韧带超声弹性模量，系统自动计算出Q-BOX区域内韧带的超声弹性模量值(单位: KPa)，为保证数据准确性以上超声检查由同一人完成。见封三彩图1～2。

MCL、LCL的HE染色光镜观察：各组兔于干预结束1周后麻醉过量法处死，进行取材，沿股骨内上髁至胫骨内侧髁、股骨外上髁至腓骨头外侧面的皮肤切开，剥离皮下浅筋膜，暴露MCL、LCL后，取MCL、LCL中段约0.5 cm×0.3 cm×0.2 cm长作为光镜观察标本，4℃下4%多聚甲醛固定48 h，固定后进行脱水、透明、包蜡，切片厚度6 μm，HE染色光镜观察。

1.6 统计分析

2 结果

2.1 软骨HE染色光镜观察结果

2.1.1 正常组 软骨表面平整光滑，细胞排列有序，胞体形态正常，细胞无簇集，无血管翳生成。见封三彩图3。

2.1.2 模型组 软骨表面粗糙、剥脱，细胞排列无序，胞体结构破坏。见封三彩图4。

2.2 SWE检测MCL、LCL的超声弹性模量结果

2.2.1 MCL的超声弹性模量结果 与正常组比较，模型组MCL超声弹性模量降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，针刀组、电针组MCL超声弹性模量上升，差异无统计学意义(P>0.05)；与电针组比较，针刀组MCL超声弹性模量上升，差异无统计学意义(P>0.05)，但上升趋势更接近正常组。见表1。

表1 MCL的超声弹性模量比较

注：与正常组比较，**P<0.05。

2.2.2 LCL的超声弹性模量结果 与正常组比较，模型组LCL超声弹性模量降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，针刀组、电针组LCL超声弹性模量上升，差异有统计学意义(P<0.05)；与电针组比较，针刀组LCL超声弹性模量上升，差异无统计学意义(P>0.05)，但上升趋势更接近正常组。见表2。

表2 LCL的超声弹性模量比较

注：与正常组比较，**P<0.05；与模型组比较,▲P<0.05。

2.3 MCL、LCL的HE染色光镜观察结果

2.3.1 正常组 成纤维细胞核分布均匀、结构完整呈椭圆形，胶原纤维排列有序。见封三彩图5～6。

2.3.2 模型组 成纤维细胞核排列无序、数量明显增多、胞核固缩，胶原纤维排列杂乱、甚至断裂。见封三彩图7～8。

2.3.3 针刀组 对比正常组，成纤维细胞核数量稍多、细胞核形态改变较小，胶原纤维排列较规则；对比模型组，胞核分布均匀、排列基本沿着胶原纤维的方向。见封三彩图9～10。

2.3.4 电针组 对比正常组，成纤维细胞核数量稍密集、纤维排列较无序；对比模型组，胞核形态改变较小，纤维排列趋于规整，少数断裂。见封三彩图11～12。

与模型组比较，针刀及电针干预后，从组织形态学角度观察KOA兔MCL、LCL都有不同程度的改善。与电针组比较，针刀组KOA兔MCL、LCL的成纤维细胞形态、胶原纤维排列更趋于正常组。说明针刀干预较电针对KOA兔内、外侧副韧带的修复作用更佳。

3 讨论

软骨基质降解是KOA重要病理标志，近年来研究发现韧带力学变化和软骨基质降解密切相关。韧带属粘弹性材料，是一种参与关节活动、维持关节稳定性的重要力学组织，其硬度增强有利于维持膝关节的稳定性，该特性会受到关节制动的影响[12]。有学者发现制动后可导致MCL单位横截面积内合成的胶原纤维数量降低，基质降解增加，韧带生物力学特性的改变可造成骨关节应力变化，最终导致KOA软骨基质的退变[3,13]。由此可知，韧带的生物力学变化在KOA发展进程中有重要的影响，那么改善韧带力学性能或许可以成为治疗KOA的新思路。

实时剪切波超声弹性成像技术采用“马赫锥”原理，追踪组织中剪切波的传播速度，通过UltraFAST技术、彩色编码技术及Q-BOXTM定量分析系统测量组织的超声弹性模量值。当韧带的力学性能发生变化后，可利用SWE技术追踪韧带组织中的剪切波传播速度，获得其超声弹性模量值从而定量评估韧带组织的硬度，超声弹性模量与组织硬度呈正比，值越大说明组织硬度越高。张长杰等[13]研究发现，制动后模型组KOA兔膝周韧带弹性模量值较正常组显著下降。课题组前期研究发现，针刀干预伸肌即股四头肌可有效改善KOA兔膝周韧带的拉伸弹性模量，但以屈肌为主的干预尚未有相关研究。

本实验选取KOA兔腘绳肌即屈肌群止点处进行干预，作为股四头肌的拮抗肌，腘绳肌包括半腱半膜肌、股二头肌，其在KOA疾病发展进程中的作用不可忽视。研究发现，单纯干预腘绳肌，可使大腿肌群力量增加，静态及动态平衡能力随腘绳肌力量增加而增强，以腘绳肌肌力训练为主的康复比以伸肌为主的训练康复更能改善KOA症状[14-15]。

SWE结果显示，模型组KOA兔MCL、LCL的超声弹性模量与正常组相比显著下降，HE染色结果显示MCL、LCL的成纤维细胞核排列无序、数量明显增多、胞核固缩、胶原纤维排列杂乱甚至断裂，说明KOA兔的韧带力学效应确有改变，组织结构紊乱、硬度下降。针刀及电针干预后，MCL超声弹性模量值升高，针刀组上升趋势较电针组更明显；LCL超声弹性模量值升高，针刀组上升趋势较电针组更明显且较模型组显著上升(P<0.05)。针刀组HE染色结果显示对比正常组，成纤维细胞核数量稍多、细胞核形态改变较小，胶原纤维排列较规则，对比模型组，胞核分布均匀、排列基本沿着胶原纤维的方向；电针组HE染色结果显示对比正常组，成纤维细胞核数量稍密集、纤维排列较无序，对比模型组，胞核形态改变较小，纤维排列趋于规整，少数断裂。综合SWE测得的弹性模量及形态学观察结果提示针刀和电针均可提高KOA兔膝关节内外侧副韧带的弹性模量，且针刀组略优于电针组。

前期研究发现，针刀较电针可增强关节周围软组织刚度，增强其变形能力，这与本次研究结果一致[16-17]。针刀医学认为关节力学失衡是KOA发病的首要病理机制，在维持膝关节动态平衡的静力性系统中，内、外侧副韧带发挥着最重要的作用。由本实验结果可知，针刀松解腘绳肌，能够促进MCL、LCL的再修复，使软骨基质退变减缓、软骨细胞的凋亡减少。针刀通过松解膝周粘连的软组织，对肌肉韧带的高应力点进行减张减压，改善因肌肉韧带等软组织病变引起的疼痛、神经卡压的相关症状，进而恢复膝关节力学的动态平衡状态最终实现治疗KOA。电针主要利用疏密波加强肌肉收缩，改善膝周局部血供，抑制痛觉向中枢神经的传导来缓解KOA疼痛的症状，对改善KOA力学失衡的作用有限。

综上可知，针刀松解腘绳肌及电针均能提高KOA兔膝关节内、外侧副韧带的超声弹性模量，且针刀组比电针组的效果更佳，那么针刀松解腘绳肌治疗膝骨关节炎或许是值得研究的一个新的方向。