基于网络药理学探讨四君子汤防治酒精性肝病的作用机制*

黄 铭 王林燕 窦晓兵 杜仲燕#

1 浙江中医药大学生命科学学院 浙江 杭州 310053

2 浙江中医药大学中医药科学院 浙江 杭州 310053

酒精性肝病（ALD）是一种由于长期过度饮酒导致的脂肪性肝脏疾病。近年来研究显示，我国酒精性肝硬化占肝硬化发病总数的比例呈逐年上升态势[1-2]。然而ALD的临床治疗缺乏理想用药，中医中药正受到肝病学界的广泛关注。1992年，中国中医药学会肝病委员会制定了脂肪肝的辨证分型标准，且经过临床统计发现以肝郁脾虚型患者较多[3]。因此，益气健脾在ALD的治疗中非常重要，四君子汤是益气健脾的代表方，据临床报道，运用四君子汤加减治疗ALD疗效显著，未发现明显的副作用[4-5]。但作用机制尚未得知，仍亟需解决。本研究通过网络药理学方法，对四君子汤多成分-多靶点-多通路防治ALD的复杂网状关系进行研究，旨在为揭示四君子汤作用机制的科学内涵提供参考。

1 资料与方法

1.1 网络药理学工具：中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）获取四君子汤活性成分及靶点；TTD数据库、Drugbank数据库、DisGeNET数据库获取酒精性肝病靶点；基因相互作用检索工具STRING数据库进行PPI分析；Venny2.1工具映射共同靶点并绘制韦恩图；Cyto‐scape3.7.0软件构建网络，并通过其ClueGO插件进行GO和KEGG分析。以上工具的使用时间截止至2019年7月。四君子汤防治ALD的研究路线图见图1。

图1 四君子汤防治ALD的研究路线图

1.2 四君子汤主要活性成分以及靶点预测：本研究通过 TCMSP数据库，以 REN SHEN，GAN CAO，FU LING，BAI ZHU为关键词，检索四君子汤的全部化学成分。并基于TCMSP数据库中ADME参数对化学成分进行筛选，主要采用口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%及类药性指数（Drug-like Index，DL）≥0.18这两项指标作为筛选标准。随后逐一收集有效活性成分的潜在靶点，再通过Unipot数据库对靶点名称进行标准化。

1.3 ALD相关靶点获取：通过TTD、Drugbank和Dis‐GeNET数据库以“Alcoholic Liver Disease”为关键词检索获取ALD疾病相关的靶点，并去重。

1.4 四君子汤防治ALD的靶点映射：通过Venny 2.1获取四君子汤防治ALD的靶点交集，并将交集的靶点导入Cytoscape软件中构建“四君子汤-防治ALD靶点-对应活性成分”可视化网络图。

1.5 成分-靶点和蛋白-蛋白互作网络分析：为探索靶点蛋白之间的相互作用，将四君子汤防治ALD的靶点上传至STRING数据库中，获取PPI网络，再通过R语言分析STRING中获取的文件，并绘制Barplot图。

1.6 GO和KEGG分析：把四君子汤防治ALD的靶点上传至Cytoscape的ClueGO插件，进行GO功能注释和KEGG信号通路的富集分析(P＜0.01)。

2 结果

2.1 四君子汤活性成分筛选：通过检索TCMSP数据库Ingredients选项，并根据OB≥30%，DL≥0.18筛选各获得人参22个、白术7个、茯苓15个和甘草92个活性成分，去重后，获得四君子汤135个活性成分。

2.2 四君子汤靶点预测：根据获取的135个活性成分，再通过TCMSP数据库，逐一获取相对应的靶点，结果显示人参对应靶点有256个（其中5个活性成分无靶点信息），白术有23个（其中3个活性成分无靶点信息），茯苓有30个，甘草有1769个，去重后共为258个潜在靶点。在Uniprot数据库中标准化后，获得214个预测靶点。通过检索TTD、DrugBank、DisGeNET数据库，各检索获得ALD相关靶点0个、16个、84个，去重后共100个靶点，与药物靶点映射，共得到21个四君子汤防治ALD的靶点（图2和图3）。

图2 四君子汤防治ALD对应靶点

图3 四君子汤防治ALD具体靶点

2.3 PPI网络的构建：为了更好地理解四君子汤防治ALD的作用机制，基于PPI关系，利用STRING数据库构建了四君子汤防治ALD相关靶点的PPI网络（图4）。PPI网络包含21个蛋白质节点，81条相互作用关系（连线），其中1个蛋白质节点无相互作用关系。再通过R语言计算靶点的degree，并绘制Barplot图，显示IL1B、IL6、CCL2、CXCL8、IL10、STAT3、NFE2L2、PPARG、SPP1、NR3C1为排名前10的核心靶点（图5）。

图4 四君子汤防治ALD靶点的PPI网络

图5 四君子汤防治ALD排名前10的核心靶点

2.4 网络构建及分析：使用Cytoscape软件构建ALD-四君子汤活性成分-作用靶点的网络模型，如图6所示。从图中可以看出，68个活性成分的21个潜在治疗靶点对比到ALD上，不同的活性成分可作用于相同的靶点，也可作用于不同的靶点，根据Degree值筛选，排名前2的活性成分分别为quercetin（槲皮素，18）、kaemp‐ferol（山萘酚，15）、licochalcone a（利可考酮，4）、naringenin（柚皮苷，4）、formononetin（福莫宁，4）、isorhamnetin（异鼠李素，4）；排名前3的靶点为PPARG（69）、MAPK14（48）、GSTP1（5）。

图6 四君子汤防治疗ALD的靶点-成分网络关系图

2.5 候选靶基因功能分析：根据四君子汤防治ALD相关的靶基因，通过Cytoscape软件的ClueGO插件进行GO生物学功能和KEGG信号通路的富集分析，发现参与调节RNA聚合酶Ⅱ转录pri-miRNA、急性炎症反应的调节、过氧化氢的生物合成过程等9个功能组被显著富集，其作用涉及脂质储存的负调控、脂质储存、急性炎症反应的调节等生物学功能的调控（图7）。KEGG信号通路富集发现，主要和糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、细胞色素P450对异生物的代谢、IL-17信号通路、TNF信号通路、PPAR信号通路等信号通路相关（图8）。

图7 四君子汤治疗ALD的GO生物功能富集结果

图8 四君子汤防治ALD的KEGG信号通路富集结果

3 讨论

ALD虽然致病因素单一，但致病机制复杂，目前认为细胞损伤、氧化应激、代谢异常、炎症、免疫损伤等均可导致ALD，临床尚缺乏安全有效的药物[6]。中医古籍中“伤酒”“酒疸”等描述与ALD十分相似，临床统计发现以肝郁脾虚型患者较多。四君子汤始载于《太平惠民和剂局方》，由人参、甘草、茯苓、白术四味药组成，是益气健脾的简易名方[7]。临床研究发现四君子汤加减治疗ALD疗效显著；动物实验研究表明，四君子汤对急性酒精肝损伤模型具有较好的治疗效果[8]。

为了系统探讨四君子汤防治ALD的具体机制，本研究通过网络药理学方法，采用TCMSP平台筛选出四君子汤防治ALD的活性成分135个，有槲皮素、山奈酚、迪奥普、豆甾醇、β-谷固醇、菊黄素、鬼臼胺等成分直接、间接地作用于CCL2、CXCL8、IL10、STAT3、PPARG等靶点，涉及脂质储存的负调控、脂质储存等GO生物学功能，涉及PPAR、IL-17、TNF等信号通路。

本研究使用Cytoscape软件构建活性成分-作用靶点网络筛选得到排名前2的核心活性成分为槲皮素和山奈酚。多项研究证实，槲皮素可改善ALD小鼠的氧化损伤、细胞凋亡以及肝脂肪变性，机制可能与调节脂质吞噬[9]等相关。山奈酚可显著降低ALD小鼠氧化应激以及脂质过氧化水平，并增加抗氧化防御活性，可能与降低肝脏CYP2E1的表达水平和活性有关[10]。

本研究根据STRING和Cytoscape筛选核心靶点，排名前1的为PPARG。PPARG是过氧化物酶体增生激活受体γ，在脂质代谢和预防氧化应激中具有重要作用[11]，肝脏内的PPARγ可促进肝脏脂肪变性及炎症，从而导致酒精诱导的肝损伤[12]。GO生物学功能富集分析也发现与脂质代谢、脂质调控、炎症反应密切相关。KEGG信号通路富集分析亦发现与PPAR信号通路密切相关。氧化应激和脂质过氧化是ALD的重要发病机制，由此推测四君子汤主要通过作用上述受体及对应信号通路来防治ALD。

综上所述，本研究采用网络药理学的方法，验证了四君子汤多成分-多靶点-多途径治疗ALD的作用特点，预测了四君子汤防治ALD可能与脂质代谢、脂质调控、炎症反应等相关，涉及的通路有PPAR信号通路、TNF信号通路等，核心靶点可能是PPARG，为后续实验验证提供了思路和依据，也为阐明四君子汤防治ALD的机制提供新思路和新方法，更为四君子汤这一中医经典方的现代临床应用提供依据。