风味蛋白酶水解蓝圆鲹工艺及酶解液抗氧化活性初探

黄茂坤，林志杰

食源性海洋生物资源是当下食品科学界研究开发的热门对象.蓝圆鲹，俗称“巴浪鱼”，是东南沿海常见的低值渔获产品，捕捞量大，但由于易腐烂、不耐贮藏，鲜销少，常加工为鱼干［1］，甚至直接制作成饲料，加工水平有待提升.据研究［2］，蓝圆鲹鱼肉中含有人体必需的氨基酸，包括婴儿必需的组氨酸，是一种优质的海洋生物资源.生物酶解技术具有反应条件温和、高效、环保、便于操作等优点，可作为蓝圆鲹高值化开发利用的主要技术手段，比如利用某些蛋白酶对蓝圆鲹进行酶解处理后，可将蓝圆鲹蛋白水解成小分子多肽或彻底水解成氨基酸，水解液可以进一步开发为海鲜风味饮料、抗氧化活性肽等高附加值产品，特别是抗氧化活性肽产品，是当前的研究热点，蒋海萍等［3］的研究表明，蓝圆鲹多肽具有较强的抗氧化活性.本试验从高值化加工的角度出发，采用风味蛋白酶对蓝圆鲹进行水解处理，在优化pH、水解温度、酶添加量、料液比等工艺条件的基础上，初步探究了蓝圆鲹风味蛋白酶水解液的体外抗氧化活性.

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

蓝圆鲹，市售；风味蛋白酶（食品级，江苏锐阳生物科技有限公司）；氢氧化钠（AR，西陇科学股份有限公司）；甲醛（AR，西陇科学股份有限公司）；硼酸（AR，西陇科学股份有限公司）；盐酸（AR，西陇科学股份有限公司）；乙醇（AR，西陇科学股份有限公司）；甲基红（IND，西陇科学股份有限公司）；亚甲基蓝（IND，西陇科学股份有限公司）；过氧化氢（AR，西陇科学股份有限公司）；硫酸铜（AR，西陇科学股份有限公司）；硫酸（AR，西陇科学股份有限公司）；硫酸钾（AR，西陇科学股份有限公司）；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）（98%，上海源叶生物科技有限公司）；水杨酸（AR，西陇科学股份有限公司）；硫酸亚铁（AR，西陇科学股份有限公司）；双氧水30%（AR，西陇科学股份有限公司）.

1.2 仪器与设备

J330 型绞肉机（奥克斯集团）；JYL-C012型多功能料理机（九阳股份有限公司）；HYP-308 型消化炉（上海纤检仪器有限公司）；KDN-103F 型自动凯氏定氮仪（上海纤检仪器有限公司）；AL104-IC 型电子天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；TG16-WS型台式高速离心机（湖南湘仪实验仪器制造有限公司）；PE20 型PH 计（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；SHB-Ⅲ磁力搅拌水浴锅（金坛市良友仪器有限公司）；78HW-1 型恒温磁力搅拌器（金坛市忆通电子有限公司）；T6 新世纪紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）.

1.3 试验方法

（1）原料处理.将蓝圆鲹内脏去除，清洗后沥干，绞碎拌匀，按一定质量分装好并置于-18 ℃冰箱中保存.

（2）工艺流程.取预先分装好的原料一份→解冻后加入原料质量1 倍的蒸馏水，置于料理机中匀浆→称取一定质量匀浆后的原料→按酶解工艺的料液比要求补齐蒸馏水→按酶解工艺要求调节pH→按工艺要求的添加量加入风味蛋白酶（本试验风味蛋白酶添加量均以解冻后的蓝圆鲹原料质量为基数）→置于预先设置好温度的磁力搅拌水浴锅中恒温酶解一段时间→于95 ℃水浴中加热处理10 min进行灭酶→冷却后离心处理→按规范获取上清液，进行相关指标的测定.

（3）风味蛋白酶水解蓝圆鲹工艺的单因素试验设计.本试验以蓝圆鲹蛋白水解度作为优化酶解工艺条件的考察指标，将风味蛋白酶水解时间固定为4 h，分别考察pH、水解温度、酶添加量、料液比四个因素对酶解效果的影响，每组试验平行做三次，试验结果取平均值，具体设计如下：

①将风味蛋白酶添加量、水解温度、料液比分别固定设置为3.5%、55 ℃、1∶6，考察pH为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5 时风味蛋白酶对蓝圆鲹蛋白的水解效果.

②将风味蛋白酶添加量、pH、料液比分别固定设置为3.5%、6.0、1∶6，考察风味蛋白酶水解温度为40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃时风味蛋白酶对蓝圆鲹蛋白的水解效果.

③将风味蛋白酶水解温度、pH、料液比分别固定设置为55 ℃、6.0、1∶6，考察风味蛋白酶添加量为0.5%、1.5%、2.5%、3.5%、4.5%、5.5%时风味蛋白酶对蓝圆鲹蛋白的水解效果.

④将风味蛋白酶添加量、水解温度、pH 分别固定设置为3.5%、55 ℃、6.0，考察水解体系料液比为1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8 时风味蛋白酶对蓝圆鲹蛋白的水解效果.

（4）风味蛋白酶水解蓝圆鲹工艺的正交试验设计.本试验不考虑工艺条件的交互作用，以蓝圆鲹蛋白水解度为考察指标，在上述单因素试验的基础上，确定出pH（A）、水解温度（B）、酶添加量（C）、料液比（D）四个因素的水平范围（见表1），采用L16（45）设计正交试验，于水解时间为4 h 的条件下进一步优化风味蛋白酶水解蓝圆鲹蛋白的工艺条件.

表1 L16（45）正交试验因素水平表

（5）蓝圆鲹蛋白酶解液体外抗氧化活性试验设计.本试验在上述酶解工艺条件优化的基础上，将风味蛋白酶水解工艺的pH、水解温度、酶添加量、料液比分别固定设置为6.0、55 ℃、3.5%、1∶6，以DPPH 自由基清除率为指标，考察不同酶解时间1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h 处理蓝圆鲹蛋白后其酶解液体外抗氧化活性的变化情况.

1.4 指标测定方法

（1）总氮含量的测定.采用GB5009.5-2016 凯式定氮法测定总氮含量.

（2）氨基态氮含量的测定.采用甲醛电位滴定法［4］测定氨基态氮含量.

（3）水解度的计算公式［5］.

（4）DPPH 自由基清除率的测定［6］.以95%乙醇溶解DPPH，配成浓度为10 mmol/L 的溶液.在分光光度计上以2 mL 样品液与2 mL 95%乙醇混匀后的溶液调零，取2 mL 样液与2 mL DPPH 溶液混合摇匀，室温下避光放置30 min 后测517 nm 处的吸光度，记为A样.空白管以95%乙醇代替样品，测定吸光度，记为A空.每个样品重复测定3 次，取平均值.

2 结果

2.1 风味蛋白酶水解工艺试验结果

（1）单因素试验结果分析.

①pH 对蓝圆鲹蛋白水解效果的影响.以测得的蓝圆鲹蛋白水解度为纵坐标，以风味蛋白酶水解体系的pH 为横坐标，绘制水解度与pH 的关系曲线，如图1 所示，随着pH 的增长，风味蛋白酶对蓝圆鲹蛋白的水解效果呈先升高后降低的趋势，水解效果最佳时pH 为6.0.从试验结果可知，pH 对风味蛋白酶催化活性的发挥具有一定的影响，因为风味蛋白酶本身是一种蛋白质，具有两性性质，其所处溶液的酸碱性（即pH 高低）会使其解离情况发生变化，从而影响其催化活性.

图1 pH 对蓝圆鲹蛋白水解度的影响

②水解温度对蓝圆鲹蛋白水解效果的影响.以测得的蓝圆鲹蛋白水解度为纵坐标，风味蛋白酶水解温度为横坐标，绘制水解温度与水解度的关系曲线，如图2 所示，在40～55 ℃的温度范围内，风味蛋白酶对蓝圆鲹蛋白的水解度随着温度的升高而升高，超过55 ℃开始呈下降趋势，说明在催化水解蓝圆鲹蛋白的过程中，55 ℃左右是风味蛋白酶发挥催化活性的适合温度条件，偏离这个温度太远，会影响风味蛋白酶催化活性的发挥，降低水解效果.

图2 水解温度对蓝圆鲹蛋白水解度的影响

③酶添加量对蓝圆鲹蛋白水解效果的影响.以测得的蓝圆鲹蛋白水解度为纵坐标，风味蛋白酶添加量为横坐标，绘制酶添加量与水解度的关系曲线，如图3 所示，风味蛋白酶的水解效果随着酶添加量的增加而呈现逐步升高的趋势，当酶添加量为3.5%时，蓝圆鲹蛋白水解度达到峰值，当酶添加量超过3.5%以后，蓝圆鲹蛋白水解度变化开始趋缓甚至略有下降，说明在其他酶解条件固定的情况下，改变风味蛋白酶添加量可以改变其对蓝圆鲹蛋白的水解效果，并且存在一个最佳值，超过最佳值，风味蛋白酶反而会抑制自身对蓝圆鲹蛋白的催化水解作用，导致水解度降低.

图3 酶添加量对蓝圆鲹蛋白水解度的影响

④料液比对蓝圆鲹蛋白水解效果的影响.以测得的蓝圆鲹蛋白水解度为纵坐标，风味蛋白酶水解体系料液比为横坐标，绘制料液比与水解度的关系曲线，如图4 所示，随着反应体系加液量的升高，蓝圆鲹蛋白水解度呈先升高后降低的趋势，当料液比为1∶6 时，风味蛋白酶对蓝圆鲹蛋白的水解效果最好，原因可能是：在磁力搅拌作用下的液体反应体系中，风味蛋白酶与蓝圆鲹原料颗粒要碰触在一起才能发生水解反应，反应体系的液体量过多或过少都不利于他们充分接触，从而影响水解效果.

图4 料液比对蓝圆鲹蛋白水解度的影响

（2）正交试验结果分析.风味蛋白酶水解蓝圆鲹蛋白的正交试验结果见表2，对试验结果进行极差分析（见表3）可知，风味蛋白酶水解蓝圆鲹蛋白的4 个工艺条件的最佳组合为A2B3C2D3，即pH=6.0、水解温度为55 ℃、酶添加量为3.5%、料液比为1∶6.对试验结果进行方差分析（见表4）可知，四个试验因素均对试验结果的影响显著，对试验结果的影响大小为：A（pH）＞D（料液比）＞C（酶添加量）＞B（水解温度）.在酶解时间为4 h 的条件下，采用上述最佳工艺水解蓝圆鲹样品进行验证试验，测得蓝圆鲹蛋白水解度为38.71%.

2.2 蓝圆鲹蛋白酶解液体外抗氧化活性试验结果

表2 正交试验结果

表3 极差分析结果

表4 方差分析结果

表5 不同水解时间对蓝圆鲹蛋白水解度及酶解液抗氧化活性的影响

DPPH 自由基是一种很稳定的氮中心自由基，常用于抗氧化成分的体外抗氧化性评价，DPPH 自由基清除率越大表明抗氧化能力越强［7］.从表5 可知，随着水解时间的延长，蓝圆鲹蛋白水解度逐渐升高，但4 h 以后变化开始趋缓，为此，本试验只选取水解时间为1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h 的酶解液测定DPPH 自由基清除率.结果表明，水解时间为3 h 的蓝圆鲹蛋白酶解液的DPPH 自由基清除率最大，DPPH 自由基清除率与水解度之间并无明显作用规律，这可能是因为酶解液抗氧化活性与其中所含小分子多肽上的基团有关，随着水解时间的推进，在提高蓝圆鲹蛋白水解度的同时，其蛋白质分子被分解为小分子多肽的情况也在发生变化，因此呈现出抗氧化活性不同的现象.

3 讨论与结论

近年来，国内外诸多学者研究利用蛋白酶酶解海洋低值鱼，实现海洋低值蛋白资源高值化，积累了一些技术经验［8］.在借鉴相关经验的基础上，本试验在水解时间为4 h 的条件下，对风味蛋白酶水解蓝圆鲹蛋白的工艺条件进行优化，得出最佳组合：pH=6.0、水解温度为55 ℃、酶添加量为3.5%、料液比为1∶6，采用该工艺条件水解处理蓝圆鲹蛋白，水解度为38.71%.研究表明，许多生物活性肽在母体蛋白中不一定具有活性，但在体外采用生物酶解等方法处理后，一些具有抗氧化活性的肽片段就会被释放［9］.本试验固定pH=6.0、水解温度55 ℃、酶添加量3.5%、料液比1∶6，考察了不同水解时间条件下蓝圆鲹蛋白水解度与酶解液DPPH 自由基清除率的变化情况，发现DPPH 自由基清除率的变化与水解度的变化无明显的相关性，但蓝圆鲹风味蛋白酶水解液具有一定的体外抗氧化活性，其DPPH 自由基清除率的最大值为80.19%.试验初步证明，采用风味蛋白酶水解处理蓝圆鲹，其产物可作为开发抗氧化活性肽产品的潜在资源，未来可对该酶解产物的其他体外抗氧化活性指标和体内抗氧化活性进行深入研究，以期为蓝圆鲹高附加值产品的开发提供技术参考.