补肺汤通过TGF-β/Smad3信号通路抑制小鼠肺纤维化的研究*

刘炜，骆新，沈静

(1.新疆医科大学第五附属医院药学部，乌鲁木齐 830011；2.新疆医科大学药学院，乌鲁木齐 830011)

肺纤维化(pulmonary fibrosis)是指病因未明的弥漫性肺间质疾病，以慢性进行性肺间质阳性反应和细胞基质动态沉积为主要病理特征，也可累及肺泡上皮细胞及肺血管，临床表现以慢性咳嗽，低氧性呼吸衰竭[1]。近年来肺纤维化患病率逐年上升，中老年男性多发，确诊后平均生存时间仅为2.8～4.2年。肺纤维化的发病机制至今尚不清楚，但是成纤维细胞的活化和细胞外基质中I型胶原蛋白的过度沉积是肺纤维化的特征性病理变化，所以α平滑肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)和I型胶原蛋白(Collagen I)是反映肺纤维化疾病进程的常见指标[2]。转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)被认为是参与肺纤维化发生发展多个环节的关键致纤维化因子，而其功能的发挥依赖于Smad3蛋白的信号转导，与肺纤维化的形成密切相关[3]。肺纤维化的临床用药以西药，如醋酸泼尼松龙、氢化可的松、吡非尼酮等为主，其治疗效果有限，副作用明显[4]。因此，寻找疗效好且副作用低的肺纤维化治疗新手段迫在眉睫。

中医认为肺纤维化属于肺痿，《金匮要略》论治虚寒肺痿集中于补肺益气、健脾化痰、活血化瘀等。补肺汤出自李仲南所著《永类钤方》，全方具有补肺健脾益肾，止咳化痰平喘、降逆止咳之功效，目前临床多用于治疗肺系疾病，疗效显著，如慢性阻塞性肺疾病、支气管哮喘等[5-6]。但其对肺纤维化的治疗作用及作用机制笔者尚未见报道，所以本实验通过研究补肺汤对肺纤维化小鼠血清中羟脯氨酸(hydroxyproline，Hyp)，透明质酸(hyaluronic acid，HA)，层黏连蛋白(laminin，LN)的含量的影响，从形态学和病理组织学分析其对小鼠的肺纤维改善情况，及从调节TFG-β/Smad3信号通路的角度揭示该方对肺纤维化小鼠的治疗作用及其机制，为抗肺纤维化药物的研究提供科学的途径。报道如下。

1 材料与方法

1.1实验动物 无特定病原体(SPF)级雄性C57BL/6小鼠，8周龄，体质量18～22 g，由新疆医科大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK(新)2018-0002，动物饲养环境SPF级，日光灯照明，空调控温，分笼饲养，可自由摄食水，饲养温度为(22±2)℃。

1.2试剂 注射用盐酸博来霉素(日本化药株式会社，批号：18051511)，吡非尼酮胶囊(北京康蒂尼药业有限公司，批号：151010)，补肺汤免煎颗粒(熟地黄24 g、桑白皮9 g、人参 9 g、五味子6 g、紫菀9 g、黄芪24 g)购买自四川大冢制药有限公司。TGF-β、p-Smad3、α-SMA、Collagen I以及甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)等单克隆抗体均购买自Abcam公司，山羊抗兔HRP -IgG抗体(美国Santa Cruz公司，批号：69080030)。苏木精-伊红(HE)染色试剂盒(批号：180620)，Masson染色试剂盒(批号：180629)，电致化学发光(ECL)试剂盒(批号：PH0353)均购自北京索宝来科技有限公司。羟脯氨酸测试盒(南京建成生物工程有限公司，批号：181201)。透明质酸试剂盒(批号：20181203)，层黏连蛋白试剂盒(批号：20180902)购自天津九鼎医学生物工程有限公司。

1.3动物分组及模型制备 小鼠适应性喂养1周后，随机分为正常对照组10只，造模组40只。造模前12 h均禁食不禁水。造模组小鼠以10%水合氯醛麻醉，仰卧固定头和四肢于实验台，常规消毒，沿颈部正中线切口，钝性分离颈部软组织，暴露气管，经气管软骨环间隙缓慢注入博来霉素0.9%氯化钠溶液5 mg·kg-1。注射后迅速将小鼠直立并旋转，使药液在肺内均匀分布，正常对照组小鼠麻醉后气管内滴注等量0.9%氯化钠溶液。造模当天及术后3 d 内，所有小鼠颈部缝合处喷撒青霉素粉末。

1.4干预方法 造模后第3天，随机将博来霉素诱导的40只小鼠分成4组，分别是模型对照组，吡非尼酮组，补肺汤小、大剂量组，每组10只，以未造模10只小鼠为正常对照组。吡非尼酮组小鼠灌胃给予吡非尼酮300 mg·kg-1。补肺汤小、大剂量组分别灌胃给予补肺汤3，12 g·kg-1。正常对照组和模型对照组小鼠给予等量0.9%氯化钠溶液。连续给药28 d，每天一次。

1.5补肺汤对肺纤维化小鼠血清中HYP、HA、LN水平的影响 给药28 d后，所有动物禁食不禁水24 h，左心腔取血法处死，鼠血3000 r·min-1(r=10 cm)离心15 min，分离血清，-20 ℃冻存备用。采用化学免疫法检测各组小鼠HYP水平，放射免疫测定法检测HA、LN水平。

1.6肺组织形态学以及组织病理学变化 小鼠处死后，暴露胸腔以分离肺组织，摄像并分析肺形态学改变。结扎并分离右上肺，置于4%多聚甲醛中固定，乙醇逐级脱水，浸蜡包埋，病理切片行HE染色及Masson染色，肺泡炎和非纤维化评分程度评判标准参照Szapie评价方法[7]。右下肺保存在-80 ℃，用于检测组织中蛋白表达。

1.7肺组织中TGF-β、p-Smad3、α-SMA、Collagen I蛋白表达水平的检测 蛋白免疫印迹法检测各组小鼠肺组织中TGF-β、p-Smad3、α-SMA、Collagen I等蛋白的表达水平。取各组小鼠肺组织50 mg，加入提取液低温匀浆裂解，12 000 r·min-1(r=10 cm)离心10 min，取上清液，部分上清液用于BCA定量总蛋白浓度，剩余蛋白加上样缓冲液煮沸5 min。上样等量总蛋白，Bio-Rad电泳仪恒压70 V，100 min后，湿转法将蛋白条带转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。用5% 脱脂奶粉封闭PVDF膜2 h，TBST清洗3次，每次10 min。加入TGF-β、p-Smad3、α-SMA、Collagen I的单克隆抗体，4 ℃孵育过夜，TBST清洗。加入辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的IgG二抗，室温下振荡孵育1 h，TBST清洗。滴加ECL显色、暗室曝光，运用Image 获得灰度值。

2 结果

2.1补肺汤对肺纤维化小鼠HYP、HA、LN水平的影响 检测各组小鼠HYP、HA、LN水平，结果见表1。与正常对照组比较，造模成功小鼠血清中HYP、HA、LN含量显著升高(P<0.05)。与模型对照组比较，吡非尼酮组和补肺汤小、大剂量组HYP、HA、LN等含量均显著降低(P<0.05)，提示吡非尼酮和小、大剂量的补肺汤均能改善小鼠肺纤维增生情况。

表1 5组小鼠HYP、HA、LN水平检测值

Tab.1 The Levels of HYP，HA and LN in five groups of mice

组别HYPHALN正常对照组1.19±0.1833.27±3.8952.11±2.83模型对照组2.63±0.32①72.17±4.12①126.23±4.12①吡非尼酮组1.27±0.24①②30.22±2.91①②55.84±3.62①②补肺汤 小剂量组1.52±0.25①②39.88±6.18①②63.15±7.12①② 大剂量组1.33±0.16①②33.12±4.73①②59.76±4.16①②

①与正常对照组比较，P<0.05；②与模型对照组比较，P<0.05。

①Compared with normal control group，P<0.05；②Compared with model control group，P<0.05.

2.2补肺汤对PE小鼠肺形态学和病理组织学的影响 正常对照组小鼠肺脏外观大体正常；模型对照组小鼠肺颜色苍白，硬度增加且弹性差，表面呈结节性改变；补肺汤小剂量组肺表面呈现暗红色，凹凸不平，弹性稍差；补肺汤大剂量组和吡非尼酮组肺外观接近正常对照组，表面稍欠光滑，弹性较好。见图1。HE染色结果显示，正常对照组小鼠肺组织结构轮廓完整清晰，肺泡壁薄且光滑无变形，肺泡间隔未见水肿和炎性细胞浸润；模型对照组可见肺结构紊乱，肺泡闭锁、萎陷，肺泡间隔明显增厚，实质组织内可见炎性细胞浸润聚集；与模型对照组比较，吡非尼酮和小、高剂量补肺汤均可显著改善肺纤维化小鼠肺组织的病理变化，其肺泡结构较为完整，肺泡间质增厚不明显，炎症明显减轻，胶原组织沉积减少。见图1。Masson染色结果显示，正常对照组小鼠肺泡腔透亮，肺泡壁未见增厚，肺泡上皮细胞结构完整，间质未见纤维蛋白沉积；模型对照组肺泡和成纤维细胞增生，可见大量胶原纤维增生、沉积；与模型对照组比较，补肺汤小、大剂量组肺组织结构明显完整，肺纤维蛋白显著减少；吡非尼酮也可显著抑制胶原沉积，改善病理变化。见图1。与正常对照组比较，模型对照组肺泡炎和肺纤维化评分显著升高(P<0.05)，而补肺汤小、高剂量和吡非尼酮可显著降低肺泡炎和肺纤维化评分(P<0.05)。见表2。

2.3肺组织中TGF-β、p-Smad3、α-SMA、Collagen I等蛋白表达水平的检测 检测各组小鼠肺组织中TGF-β、p-Smad3、α-SMA、Collagen I等蛋白的表达水平。与正常对照组比较，模型对照组TGF-β1、p-Smad3、α-SMA、Collagen I等蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。与模型对照组比较，吡非尼酮组和补肺汤低、大剂量组肺组织TGF-β、p-Smad3、α-SMA、Collagen I等蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。见图2。

3 讨论

肺纤维化是肺间质性疾病，目前治疗尚无特效药物，临床多采用西药治疗，如醋酸泼尼松、吡非尼酮等，但价格昂贵，且存在着一定副作用[8]。《素问·痹论》认为肺纤维属于肺痿，乃“肺热叶焦，则皮毛虚弱急薄，著则生痿躄也”，提出其病机为“气虚血瘀”，尝试以益气活血为基本法则治疗。而补肺汤出自李仲南《永类钤方》，是中医治疗肺气虚的经典之方，主要由人参、黄芪、熟地、五味子、紫菀、桑白皮组成，六药合用，为益气护阴、润燥止咳，顾全肺脾肾三脏之方。方中参芪以其归脾肺经，用于补二者虚弱之气。熟地滋肾填精，滋下润上，使肺得润而降。五味子酸能收敛，性温而润，上敛肺气，下滋肾阴，用于肺肾两虚之咳喘。桑白皮归肺经泻肺化痰。紫菀性温而润，润肺之虚燥，止咳化痰，为久咳之圣药。很多学者应用补肺汤治疗肺系疾病，疗效显著[5-6]。

在肺纤维化发生时，HYP、HA、LN的含量常用来反映胶原沉积和纤维增生的程度[9]。HYP在胶原组织中占13.4%，是机体胶原纤维所特有的氨基酸，是衡量胶原组织代谢和纤维化程度的重要指标，因此检测肺组织中HYP含量常用来反映胶原纤维增生的情况[10]。HA是肺间质中主要的糖胺聚糖，广泛存在于胞外基质，为炎性细胞和成纤维细胞的增生提供大量基质，加速纤维组织的形成，是重要的血清纤维化指标[11-12]。LN主要存在于基底膜透明层中的大分子非胶原糖蛋白，能够促进成纤维细胞和上皮细胞合成胶原[13]。与正常对照组比较，模型对照组小鼠血清中HYP、HA、LN的含量显著升高，说明肺纤维化小鼠的肺纤维化程度明显加重。与模型对照组比较，补肺汤小、大剂量组可显著降低肺纤维化小鼠血清中HYP、HA、LN的水平，说明补肺汤通过抑制胶原沉积和纤维增生，对博来霉素诱导的肺纤维化小鼠发挥明确疗效。

A.正常对照组；B.模型对照组；C.吡非尼酮组；D.补肺汤小剂量组；E.补肺汤大剂量组。

A.normal control group；B.model control group；C.pifenidone group；D.low-doseBufeidecoction group；E.high-doseBufeidecoction group.

Fig.1 Pulmonary histomorphology and pathology in five groups of mice(×100)

表2 5组小鼠肺组织病理学评分

组别肺泡炎评分肺纤维化评分正常对照组0.00±0.000.00±0.00模型对照组2.59±0.63①2.77±0.29①吡非尼酮组0.83±0.79①②0.91±0.27①②补肺汤 小剂量组1.38±0.32①②1.73±0.61①② 大剂量组1.14±0.57①②1.38±0.42①②

①与正常对照组比较，P<0.05；②与模型对照组比较，P<0.05。

①Compared with normal control group，P<0.05；②Compared with model control group，P<0.05.

TGF-β是最直接的促纤维化细胞因子，通过促进间质细胞增殖、分化来诱导细胞外基质沉积，抑制肺间质细胞外基质降解，从而产生纤维化，被认为是是肺纤维化发生的诱导和启动因子[14]。Smad3是TGF-β的下游受体调节型蛋白，活化后形成p-Smad3，从而调节胶原等基因的表达，诱导并促进成纤维转化成肌成纤维细胞，从而增强细胞外基质的沉积，诱发肺组织纤维化样改变[15-16]。α-SMA是活化的成纤维细胞即肌成纤维细胞的标志，参与合成Collagen I等细胞外基质成分，促进纤维化的发生[17]。Collagen I是细胞外基质中胶原的主要成分，占正常人肺中总间质胶原的60%～70%，随着肺纤维化病程的进展，Collagen I的表达上调，在肺间质中沉积，使得肺组织结构紊乱而发生肺纤维化[18]。蛋白免疫印迹法结果显示，模型对照组中TGF-β、p-Smad3、α-SMA和Collagen I表达明显升高。TGF-β、p-Smad3的蛋白表达上调意味着TGF-β/Smad3信号通路的激活，而下游α-SMA以及Collagen I蛋白表达的上调标志着成纤维细胞的活化和胶原纤维的大量沉积。这说明肺纤维化小鼠TGF-β/Smad3信号通路被激活后，能引起成纤维细胞大量活化转化成肌成纤维细胞，从而促进胶原纤维的大量聚集，纤维化进程加快。而补肺汤小、大剂量组以及吡非尼酮组中TGF-β、p-Smad3、α-SMA和Collagen I表达均显著下降，说明补肺汤通过抑制TGF-β/Smad3信号通路，对成纤维细胞的形成和胶原沉积发挥抑制作用。

A.正常对照组；B.模型对照组；C.吡非尼酮组；D.补肺汤小剂量组；E.补肺汤大剂量组。①与正常对照组比较，P<0.05；②与模型对照组比较，P<0.05。

A.normal control group；B.model control group；C.pifenidone group；D.low-doseBufeidecoction group；E.high-doseBufeidecoction group；①Compared with normal control group，P<0.05；②Compared with model control group，P<0.05.

综上所述，本研究结果表明补肺汤可通过抑制TGF-β/Smad3信号通路，下调血清纤维化指标HYP、HA、LN的含量，抑制成纤维细胞的活化和Collagen I的表达，从而改善其肺组织纤维化和肺泡炎情况，抑制小鼠的肺纤维化的进展。