植物乳杆菌KLDS1.0386联合色氨酸对溃疡性结肠炎的影响

王娜娜,李柏良,李 娜,史佳璐,宋 月,霍贵成,李艾黎

(东北农业大学食品学院,乳品科学教育部重点实验室,黑龙江哈尔滨 150030)

炎症性肠病(Inflammatory bowel disease,IBD)是一种慢性和复发性胃肠道炎症性疾病,主要包括克罗恩病(Crohn’s disease,CD)和溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)[1]。IBD病因复杂,其发病机制与严重程度受到多种因素影响,其发病机制与严重程度受到多种因素影响,其中主要包括遗传因素、免疫反应、肠道菌群和氧化应激等因素[2]。目前治疗IBD的药物主要是抗炎或免疫抑制药物,如氨基水杨酸、皮质类固醇和硫嘌呤,但这些药物往往会引起严重的副作用[3]。

色氨酸为动物体内必需氨基酸,对肠道免疫、抑制炎症具有重要的调节作用[4]。最新的研究表明色氨酸调节肠道免疫的本质并不是色氨酸本身,而是在肠道菌群的作用下,色氨酸分解为吲哚及吲哚酸衍生物,例如吲哚丙烯酸、吲哚乙酸、吲哚-3-乳酸等可作为芳香烃受体(Aryl hydrocarbon receptor,AHR)的配体,激活免疫系统,增强肠上皮屏障,以及肠道激素的分泌,从而发挥抗炎、抗氧化或抗毒性作用[5-8]。Takamura等[9]发现乳酸菌OLL1181激活芳基烃受体途径,抑制结肠炎。目前研究发现大肠埃希菌、梭状芽孢杆菌、拟杆菌、消化链球菌具有降解色氨酸的功能,马梅蕾[10]从猪结肠中筛选出一株能够利用色氨酸的肠球菌属,但菌株存在安全性问题。乳酸菌作为有益于宿主健康的微生物,在降解色氨酸方面还未引起人们的重视。本研究以实验室保藏的16株乳酸杆菌为研究对象,筛选出一株具有降解色氨酸能力最高的菌株植物乳杆菌KLDS1.0386,其中植物乳杆菌KLDS1.0386具有降胆固醇、生长性能优良、黏附性较好等益生功能[11-12]。将植物乳杆菌KLDS1.0386作为目标菌株用于葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的溃疡性结肠炎小鼠进行体内预防实验,从而评估目标菌株对肠炎小鼠的预防作用。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

植物乳杆菌(KLDS1.0317、KLDS1.0318、KLDS1.0386、KLDS1.0344、1-2、2-2、4-5、1-5、4-4、8-6)、嗜酸乳杆菌(KLDS1.0901、KLDS1.0902、KLDS1.1003)、鼠李糖乳杆菌(1.0911、1.0912、LGG) 东北农业大学乳品科学教育部重点实验室保藏;C57BL/6N小鼠 雄性,清洁级,8周龄,购自北京维通利华实验动物技术有限公司,许可证号:SCXK(京)2016-0006;甲醇 天津市大茂化学试剂厂;L-色氨酸标准品 天津市津科精细化工研究所;葡聚糖硫酸钠(DSS) 天津阿尔法生物科技有限公司;便隐血试剂盒 上海源叶生物科技有限公司;IL-6试剂盒、IL-10试剂盒 泉州科诺迪生物技术有限公司。

DHP-9272型电热恒温培养箱 上海一恒科技有限公司;LDZF-50KB-Ⅱ立式蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂;CJ-2D超净工作台 天津泰斯特仪器有限公司;TGL-16G离心机 上海安亭科技仪器厂;UV-2401PC型紫外分光光度计 日本岛津公司;Waters 2695高效液相色谱仪 配2996二极管阵列检测器,美国Waters公司。

1.2 实验方法

1.2.1 MRS培养基 蛋白胨5.0 g,胰蛋白胨10.0 g,乙酸钠5.0 g,酵母提取物5.0 g,葡萄糖20.0 g,吐温-80 1.0 g,硫酸锰0.25 g,柠檬酸氢二铵2.0 g,硫酸镁0.58 g,磷酸氢二钾2.0 g,牛肉膏5.0 g,用蒸馏水定容至1 L,调节pH至5.8,121 ℃条件下灭菌15 min。

1.2.2 色氨酸培养基 按照上述MRS培养基配方的剂量溶解于800 mL蒸馏水,调节pH至5.8,121 ℃条件下灭菌15 min。称取2 g色氨酸加入200 mL无菌水中,使其充分溶解,用0.22 μm水系滤膜过滤除菌之后加入灭完菌的MRS培养基,混匀后即为色氨酸培养基。

1.2.3 菌株的活化 将冻存于-80 ℃条件下的16株乳酸杆菌以2%的接种量接种在MRS培养基中,37 ℃培养24 h,连续培养两代,37 ℃培养18 h备用。

1.2.4 可降解色氨酸乳酸菌的筛选

1.2.4.1 色氨酸含量的测定 配制1 g/L的色氨酸溶液,并依次将浓度稀释至0.020、0.030、0.035、0.045、0.100、0.200、0.300 g/L,进样前经0.22 μm滤膜过滤。HPLC条件:色谱柱为岛津C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相为0.03%磷酸二氢钾溶液∶甲醇=90∶10 (V∶V),使用前需经0.45 μm滤膜过滤,超声脱气;流速为1.0 mL/min;二极管检测器,检测波长为278 nm;柱温为39 ℃;进样量设置为20 μL[13]。色氨酸标准曲线为y=3.2×107x-6638.6,R2=0.9997,具有良好的相关系数,可用于样品中色氨酸含量的测定。

1.2.4.2 色氨酸降解率的计算

式中:A为各菌株发酵后培养液的色氨酸含量,g/L;C为空白对照组的色氨酸含量,g/L;重复实验3次,取平均值。

1.2.4.3 发酵液样品的处理 将活化好的乳酸菌接种于色氨酸培养基,以未接菌的色氨酸培养基作为空白对照,培养24 h后,4 ℃ 8000 r/min离心15 min,将上清液稀释一定的倍数,混合均匀后取1 mL上清液于无菌EP管,0.22 μm水系滤膜过滤置于液相进样小瓶测定样品中色氨酸的含量。

1.2.5 DSS诱导小鼠溃疡性结肠炎的预防效果探究

1.2.5.1 动物实验 将75只8周龄C57BL/6N雄鼠适应性饲养一周后随机分为5组,每组15只,即正常组、模型组、色氨酸组、1.0386组、1.0386+色氨酸组。适应性饲养7 d后,正常组和模型组在整个实验阶段内正常饮食与用水,每天灌胃无菌PBS 0.2 mL;色氨酸组每天灌胃无菌色氨酸溶液0.2 mL(含2 mg色氨酸)[14],1.0386组每天灌胃109CFU/mL的菌悬液0.2 mL;1.0386+色氨酸组每天灌胃109CFU/mL的色氨酸菌悬液(含2 mg色氨酸)。

表1 实验设计方案Table 1 The experimental design

除正常组外,其它四组从第22 d饮用2.5% DSS水溶液7 d;同时,造模期间,根据疾病活动指数评分细则每天进行评分,灌胃结束后,眼球取血,断颈处死小鼠,对所需指标进行检测。

1.2.5.2 疾病活动指数(DAI)的测定 在小鼠造模及灌胃期间每天观察记录小鼠的生长状态,包括眼神毛发、体重变化、粪便形状及便血状况。参照Joh等[15]的评分方法,计算小鼠的疾病活动指数DAI,评分细则如表2所示。

表2 DAI评分细则Table 2 DAI score rules

1.2.5.3 小鼠结肠组织长度的测定 小鼠处死后,测量盲肠末端和近端直肠之间的结肠,测量结肠长度[16]。

1.2.5.4 小鼠器官指数的测定 小鼠解剖后,分离心脏、脾脏、肝脏、肾脏,用生理盐水清洗并用滤纸吸干表面水分,然后迅速称量[17]。

器官指数(%)=器官重量(g)/体重(g)×100

1.2.5.5 小鼠结肠组织病理评估 取小鼠远端结肠(距肛门1 cm处)1 cm浸泡于甲醛中固定组织,然后石蜡包埋切片,经二甲苯脱蜡后染色,用于结肠组织病理评估[18]。

1.2.5.6 小鼠血清细胞因子的测定 灌胃结束后,眼球取血,室温下自然凝固1～2 h,7000 r/min离心5 min,收集血清,冻存于-20 ℃冰箱,收集完毕后,通过 ELISA 试剂盒,用于IL-6、IL-10的检测[19]。

1.3 数据处理与分析

采用SPSS 17.0进行显著性差异分析,实验结果采用Mean±SD表示,P<0.05为差异有显著性意义,Origin 9.0 进行绘图分析。

2 结果与分析

2.1 降解色氨酸的乳酸菌的筛选

根据高效液相色谱仪检测发酵液中色氨酸的含量,乳酸菌对色氨酸的降解作用如图1所示,其中植物乳杆菌对色氨酸具有更好的降解作用,植物乳杆菌KLDS1.0317、KLDS1.0386、KLDS1.0344、4-5对色氨酸的降解率分别为12.78%、20.43%、18.77%、15.45%,显著高于其他菌株(P<0.05)。嗜酸乳杆菌和鼠李糖乳杆菌对色氨酸的降解作用较弱,其中参考菌株LGG对色氨酸的降解率为5.51%。16株乳酸菌对色氨酸均具有不同程度的降解作用,不同菌株之间具有差异性,降解率为3.83%～20.43%,根据乳酸菌对色氨酸的降解作用的不同,选取植物乳杆菌KLDS1.0386作为后续动物实验的优良菌株。马梅蕾[10]从猪肠道内分离出一株可以利用色氨酸的肠球菌,其降解率为21.59%,而本研究筛选出的植物乳杆菌KLDS1.0386对色氨酸的降解率为20.43%,两者对色氨酸的利用程度相似,但肠球菌可能是一种具有潜在致病性的菌株,菌株的安全性不能保证,而本研究所使用的乳酸菌作为益生菌的主要来源,是被公认为安全的食品级微生物,因此筛选出一株能够高效降解色氨酸的乳酸菌,为开发具有缓解结肠炎的功能性乳酸菌提供理论基础和数据支持。

图1 16株乳酸菌对色氨酸的降解作用 Fig.1 The degradation effect oftryptophan by 16 lactic acid bacteria注:不同小写字母表示各组差异性显著(P<0.05);字母相同表示差异不显著(P>0.05);图4同。

2.2 KLDS1.0386联合色氨酸对DSS诱导小鼠溃疡性结肠炎的预防作用

2.2.1 溃疡性结肠炎小鼠体重变化 在造模期间,每日称量小鼠体重,各组小鼠的体重变化如图2所示,正常组小鼠体重平缓增加,实验结束时体重达到(27.83±0.77) g;模型组在造模前4 d时,体重保持缓慢增加,而第5 d之后,体重开始大幅度下降,在第7 d时,体重降到最低为(19.76±1.08) g,显著低于正常组(P<0.05),这与王碧莹[20]的结果一致;而其它处理组的体重也从第5 d开始出现不同程度的降低,在第7 d时,色氨酸组体重为(21.25±1.22) g,1.0386组小鼠体重为(21.73±0.98) g,1.0386+色氨酸组小鼠体重为(23.35±0.89) g。造模之前的初始体重虽略有差异,但差异不显著,而随着饮用DSS时间的延长,DSS组小鼠体重下降幅度较大,1.0386+色氨酸组能够明显缓解小鼠体重降低的趋势。

图2 各处理组对各组小鼠体重的影响Fig.2 Effect of different treatments on body weight in mice

2.2.2 KLDS1.0386联合色氨酸对DSS诱导溃疡性结肠炎小鼠DAI的影响 DAI可以反映出小鼠体重变化、大便状态以及便血情况三个方面的总体特征,DAI评分越高,说明肠炎症状越明显[21]。由图3可知,正常组小鼠的粪便正常,DAI基本为0,小鼠毛色光泽,眼神灵敏,行动反应迅速;模型组小鼠饮用DSS第4 d开始大便呈现松散的情况,部分小鼠粪便出现血迹,体重大幅度下降,DAI值逐渐升高,随着饮用DSS时间延长,模型组小鼠的粪便不成型,出现肉眼可见的红褐色血迹,黏附于肛门,DAI值达到最大值,为7.21±0.21,且小鼠毛色无光泽,精神萎靡,行动迟钝,体型消瘦,易聚堆;其它处理组在一定程度上均缓解了与模型组相似的症状,降低DAI值,色氨酸组的DAI值为3.67±0.59,1.0386组的DAI值为5.01±0.93,1.0386+色氨酸组小鼠DAI值为2.96±0.41,数据表明1.0386+色氨酸显著降低了小鼠DAI值(P<0.05)。

图3 各处理组对各组小鼠 DAI 指数的影响Fig.3 Effect of different treatments on DAI index in mice

2.2.3 KLDS1.0386联合色氨酸对DSS诱导溃疡性结肠炎小鼠结肠长度的影响 饮用DSS可使小鼠结肠缩短,结肠长度可直接反映结肠炎症的严重程度[22]。由图4可看出正常组的结肠长度最长,为(7.03±0.25) cm,而模型组小鼠结肠显著缩短,为(3.80±0.1) cm;而与模型组相比,其它处理组在一定程度上都增加了小鼠结肠长度,色氨酸组和1.0386组的结肠长度分别为(4.30±0.2)和(4.27±0.06) cm,而1.0386+色氨酸组的结肠长度为(4.77±0.06) cm,与单独使用色氨酸、1.0386相比,色氨酸+1.0386混合处理改善结肠组织缩短的效果最佳,且具有显著性(P<0.05)。

图4 各处理组对小鼠结肠长度的影响Fig.4 Effects of different treatmentson colon length in colitis mice

2.2.4 KLDS1.0386联合色氨酸对DSS诱导溃疡性结肠炎小鼠器官指数的影响 器官指数可表明不同处理组小鼠的生长状态。由表3可知,模型组的脾脏指数明显高于正常组(P<0.05),色氨酸组和1.0386组的脾脏指数低于模型组,但差异不显著(P>0.05),而1.0386+色氨酸组的脾脏指数明显低于模型组(P<0.05),与正常组无显著差异(P>0.05)。在心脏指数、肝脏指数和肾脏指数,各处理组无显著差异(P>0.05),这说明1.0386+色氨酸可有效改善肠炎小鼠的脾脏指数。脾脏与机体免疫情况相关,肠道炎症增加,使免疫系统活化,便会引起脾脏重量的增加,因此模型组的脾脏指数显著高于正常组,这与刘凌云等[23]的研究一致。

表3 各处理组对小鼠脏器指数的影响Table 3 Effects of different treatments on organ coefficients of mice

表4 各组小鼠血清炎症因子含量Table 4 Serum inflammatory factors in each group

2.2.5 KLDS1.0386联合色氨酸对DSS诱导溃疡性结肠炎小鼠结肠组织病理学的影响 HE组织染色可以反映出肠道的病变状态,肠道上皮作为肠道粘膜的重要组成部分,以自身的更新能力来保护肠道受到不同的损伤[24]。由图5 HE染色可知,正常组小鼠正常的结肠黏膜层见有丰富的杯状细胞,黏膜表层黏膜上皮细胞呈高柱状,排列整齐;隐窝呈瓶状结构,中央见有小腔或无明显腔状结构;模型组黏膜全层固有结构消失,结缔组织增生及炎性细胞浸润;与模型组相比,其它各处理组的都在一定程度上缓解了结肠组织的损伤,其中1.0386+色氨酸组明显改善了饮用DSS对小鼠结肠带来的肠道损伤,由图5e可以看出,1.0386+色氨酸组结肠粘膜层保留了大部分的杯状细胞,肠上层结构完整,炎症细胞浸润显著减轻,说明1.0386+色氨酸对结肠结构组织的保护效果最好。

图5 各处理组小鼠结肠 HE染色(×100)Fig.5 Colonic HE staining results of different groups(×100)注:a为正常组;b为模型组;c为色氨酸组;d为1.0386组;e为色氨酸+1.0386组。

2.2.6 KLDS1.0386联合色氨酸对血清细胞因子的影响 溃疡性结肠炎与炎症因子水平密切相关,采用酶联免疫吸附试剂盒在450 nm处采用酶标仪检测小鼠血清 IL-6和IL-10的含量[25]。细胞因子的标准曲线相关系数良好,如图6所示。与正常组相比,DSS组的促炎性细胞因子IL-6含量显著升高,抑炎性细胞因子IL-10的含量显著下降(P<0.05)。与模型组相比,色氨酸组、1.0386组、1.0386联合色氨酸组均可显著降低IL-6水平(P<0.05)。其次,色氨酸组和1.0386组可一定程度上提高IL-10水平,与模型组相比无显著性差异(P>0.05),而1.0386联合色氨酸可显著提高IL-10水平(P<0.05)。

图6 细胞因子的标准曲线图Fig.6 Standard curve of the serum levels of cytokines

3 结论

本实验通过高效液相色谱法筛选出一株高效降解色氨酸的乳酸菌作为优势菌株,并对优势菌株和色氨酸对溃疡性结肠炎的预防作用进行研究。通过饮用DSS建立溃疡性肠炎小鼠模型,以使用色氨酸、1.0386以及两者联合对小鼠结肠炎进行干预实验,根据小鼠临床状态表现、体重变化、DAI指数、结肠长度、器官指数、结肠组织病理学以及细胞因子为指标评估,发现1.0386与色氨酸联合对溃疡性结肠炎的缓解作用明显优于其它两组,在两者的联合作用下,有效降低DAI指数,增加结肠长度,减小脾脏指数,减轻结肠组织损伤,下调促炎因子IL-6含量,并上调抑炎因子IL-10的含量。从本实验结果来看,KLDS1.0386联合色氨酸能够更好的改善溃疡性结肠炎小鼠的效果,但具体的作用机制尚未明确,有待深入研究。