复合酶法提取长白木根总黄酮工艺优化及抗氧化活性研究

2020-06-17段红梅王丹丹江宇峰王顺余吴淑清王晓红

食品工业科技 2020年12期

段红梅,王丹丹,洪豆,江宇峰,王顺余,吴淑清,*,王晓红,*

(1.长春大学食品科学与工程学院,吉林长春 130022;2.浙江李子园食品股份有限公司,浙江金华 321031)

长白楤木(AraliacontinentalisKitagwa),又名草本刺嫩芽、牛尾大活等,药名东北土当归,与药王人参同属五加科多年生草本植物[1],营养物质极为丰富,是一种珍贵的山野菜,且具有保健功效。古医书记载其根可入药,具有祛风燥湿、解热镇痛、疏风活血和利尿解毒等功效[2]。现代临床医学表明长白楤木己得到广泛关注:Lim等人研究表明长白楤木根的成分具有明显的抗炎活性[3]。Kim等人研究证实长白楤木富含二萜、三萜、脂肪酸、黄酮类、挥发油等多种生物活性成分,并且从中分离得到一种三萜皂苷,其具有很强的降糖活性[4];长白楤木还富含黄酮类及苷类化合物,其具有较强的抗氧化活性[5]。王忠壮等人研究得到贝壳烯酸、贝壳杉醇酸、海松酸等二萜成分具有镇静作用[6]。除此之外,其根中其他成分还有降血脂、预防心脑血管、抗肿瘤和保护神经系统等功效[7]。

目前,黄酮类物质的主要提取方法有:水-有机溶剂提取法、超声波辅助提取法、酶法提取及微波辅助提取法等[8-9]。而酶法提取主要采用酶破坏植物组织细胞,使细胞壁疏松、破裂,降低传质阻力,且与溶剂乙醇联用提取黄酮类物质还具有协同作用[10-11],酶法提取具有得率高、反应条件温和、时间短、无污染等优点[12]。因此,酶法在天然产物提取方面越来越受到重视。近年来,关于酶法提取长白楤木根总黄酮的工艺及抗氧化活性的研究鲜有报道,因此试验采用纤维素酶/果胶酶辅助乙醇提取长白楤木根总黄酮,以总黄酮提取量作为考察指标,在单因素分析的基础上,通过响应面法优化,确定长白楤木根黄酮类物质的最佳提取工艺,并对三种自由基的抗氧化活性进行测定,以期为长白楤木根黄酮的研究奠定基础,为进一步开发利用长白楤木根中活性成分提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

长白楤木根由长春大学园林学院王晓红教授的实验种植基地提供;芦丁标准品(液相浓度≥98%) 国药集团化学试剂有限公司;纤维素酶(400 U/mg)、果胶酶(50000 U/g) 美国sigma公司;水杨酸、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、邻苯三酚大连美仑生物技术有限公司;2,2-联苯基-1-苦基肼基(DPPH) 上海麦克林生化科技有限公司;亚硝酸钠、硝酸铝、硫酸亚铁等试剂均为分析纯,北京化工厂。

WJX-A1000型高速多功能粉碎机上海缘沃工贸有限公司;UV-2700紫外可见分光光度计日本岛津仪器有限公司;TDL-50B低速离心机上海安亭科学仪器厂;GZX-9070MBE电热恒温鼓风干燥箱济南荣星分析仪器有限公司;NTS-4000B型恒温震荡水槽日本东京理化器械株式会社。

1.2 实验方法

1.2.1 长白楤木根预处理将新鲜长白楤木根清洗干净,置于温度为50 ℃的电热恒温鼓风干燥箱中干燥24 h,用粉碎机将烘干的样品粉碎,过80目(0.2 mm)筛,装入密封袋,冷藏保存备用。

1.2.2 长白楤木根中总黄酮的提取工艺流程长白楤木根粉→加入乙醇溶剂→酶法提取→沸水浴灭酶5 min→冷却→离心→收集上清液→总黄酮测定

1.2.3 单因素试验

1.2.3.1 提取温度对总黄酮提取量的影响准确称取1.0000 g长白楤木根粉置于150 mL三角瓶中,以50%乙醇溶液为溶剂,液料比为40∶1 (mL/g),在pH5.0的情况下,添加复合酶为5%(果胶酶∶纤维素酶=1∶1),分别在30、40、50、60、70、80 ℃水浴振荡下提取50 min,再经沸水浴灭酶5 min,样液经4000 r/min速度离心10 min后,取上清液为样品待测储备液,测定提取温度对总黄酮提取量的影响。

1.2.3.2 复合酶(果胶酶与纤维素酶)比例对长白楤木根总黄酮提取量的影响准确称取1.0000 g长白楤木根粉置于150 mL三角瓶中,以液料比为40∶1 (mL/g),50%乙醇溶液为溶剂,在pH5.0的情况下,添加复合酶(质量分数为5%),即果胶酶:纤维素酶比例分别为1∶2、1∶1.5、1∶1、1.5∶1、2∶1、2.5∶1,并在50 ℃水浴振荡下提取50 min,再经沸水浴灭酶5 min,样液经4000 r/min速度离心10 min后,取上清液为样品待测储备液,测定复合酶比例对总黄酮提取量的影响。

1.2.3.3 提取时间对总黄酮提取量的影响准确称取1.0000 g长白楤木根粉置于150 mL三角瓶中,以液料比为40∶1 (mL/g),50%乙醇溶液为溶剂,在pH5.0的情况下,添加复合酶为5%(果胶酶∶纤维素酶=1∶1),并在50 ℃水浴振荡下分别提取20、30、40、50、60、70 min,再经沸水浴灭酶5 min,样液经4000 r/min速度离心10 min后,取上清液为样品待测储备液,测定提取时间对总黄酮提取量的影响。

1.2.3.4 液料比对总黄酮提取量的影响准确称取1.0000 g长白楤木根粉置于150 mL三角瓶中,以50%乙醇溶液为溶剂,分别在液料比为20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1 mL/g,pH5.0的情况下,添加复合酶为5%(果胶酶∶纤维素酶=1∶1),并在50 ℃水浴振荡下提取50 min,再经沸水浴灭酶5 min,样液经4000 r/min速度离心10 min后,取上清液为样品待测储备液,测定液料比对总黄酮提取量的影响。

1.2.3.5 乙醇体积分数对总黄酮提取量的影响准确称取1.0000 g长白楤木根粉置于150 mL三角瓶中,液料比为40∶1 (mL/g),分别以30%、40%、50%、60%、70%、80%乙醇溶液为溶剂,在pH5.0的情况下,复合酶添加量为5%(果胶酶∶纤维素酶=1∶1),并在50 ℃水浴振荡下提取50 min,再经沸水浴灭酶5 min,样液经4000 r/min速度离心10 min后,取上清液为样品待测储备液,测定乙醇体积分数对总黄酮提取量的影响。

1.2.4 响应面试验设计在单因素试验基础上固定提取温度为50 ℃,根据Box-Behnken设计原理,以总黄酮提取量作为响应值,固定选择果胶酶与纤维素酶的比例、提取时间、液料比、乙醇体积分数4个因素作为自变量,并根据单因素试验结果进行响应面试验,试验因素水平见表1。

表1 响应面试验因素及水平表Table 1 Factors and levels of response surface test

1.2.5 长白楤木根总黄酮提取量的测定将芦丁标准品经110 ℃恒温干燥至恒重并冷却至室温备用,准确称取芦丁标品10 mg,用30%的乙醇超声溶解5 min,并定容于50 mL容量瓶中,得浓度为0.2 mg/mL的芦丁标准品溶液,冷藏保存备用[13]。分别精密吸取0、1、2、3、4、5、6 mL的芦丁标准溶液置于25 mL容量瓶,各加30%乙醇溶液至6 mL,再加入5%亚硝酸钠溶液1 mL,摇匀静置6 min,再加入10%硝酸铝1 mL,摇匀静置6 min,再加4%氢氧化钠溶液10 mL,最后用30%乙醇定容至刻度线,摇匀静置15 min,在最大吸收波长500 nm处测定吸光度,记录数据,并绘制以吸光度为纵坐标以浓度为横坐标的标准曲线,所得回归方程:y=10.232x+0.0049(R2=0.9992),式中y为吸光度,x为芦丁质量浓度(mg/mL),结果表明芦丁在0.008～0.048 mg/mL浓度范围内与吸光度呈现出良好的线性关系[14-15]。

测定样液时,精密吸取1 mL样液于25 mL容量瓶中,按照制作标准曲线的方法处理,在500 nm处测定其吸光度,根据标准曲线计算长白楤木根中总黄酮含量,按公式(1)计算如下:

式(1)

式中,T:总黄酮物质的含量,mg/g;C:通过公式计算所得的总黄酮质量浓度,mg/mL;V:总黄酮提取液体积,mL;m:称量的长白楤木根的质量,g;n:稀释倍数。

1.2.6 长白楤木根总黄酮抗氧化活性的研究

1.2.6.1 清除DPPH·测定根据Zheng[16]的方法稍作修改,分别配制不同质量浓度为0.03、0.06、0.09、0.12、0.15 mg/mL的长白楤木根总黄酮和VC溶液。准确吸取不同质量浓度的总黄酮溶液2 mL和0.1 mmol/L DPPH-乙醇溶液2 mL于试管中,充分混匀,在37 ℃恒温水浴锅中避光保存30 min,以无水乙醇为参比,以VC作为阳性对照,在517 nm处测定吸光度。按公式(2)计算DPPH·清除率。

式(2)

式中:A0为2 mL DPPH-乙醇溶液和2 mL蒸馏水的混合液吸光度;A1为2 mL DPPH-乙醇溶液和2 mL样品溶液的吸光度;A2为2 mL无水乙醇和2 mL样品溶液的吸光度。

1.2.6.2 清除羟基自由基(·OH)的测定由李多[17]的方法稍作修改,配制不同质量浓度为0.03、0.06、0.09、0.12、0.15 mg/mL的长白楤木根总黄酮提取液,同时以VC作为对照进行试验,取各质量浓度的黄酮提取液2.0 mL于试管中,向各试管中分别依次加入2 mL 6 mmol/L FeSO4溶液、6 mmol/L H2O2溶液、6 mmol/L水杨酸溶液,在37 ℃下反应1 h,以蒸馏水为参比,在517 nm波长处测定其吸光度,每个实验平行3次。按公式(3)计算羟自由基清除率。

式(3)

式中:A0为FeSO4溶液、H2O2溶液、水杨酸和蒸馏水混合液的吸光度;A1为FeSO4溶液、H2O2溶液、水杨酸和样品溶液混合液的吸光度;A2为FeSO4溶液、蒸馏水、水杨酸和样品溶液混合液的吸光度。

式(4)

式中:v0为邻苯三酚自氧化时反应速率;vt为加入样品溶液后邻苯三酚自氧化时反应速率。

1.3 数据处理

试验均设置三次重复,采用Excel 2010软件进行实验数据处理并作图,所得试验数据采用“平均数±标准差”表示,采用Design-Expert 8.0.6软件进行响应面试验数据分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 提取温度对总黄酮提取量的影响由图1可知,随着提取温度的升高,长白楤木根总黄酮的提取量也逐渐增加;当提取温度为50 ℃时,提取量达到最高为7.0 mg/g;当提取温度继续升高,长白楤木根总黄酮的提取量逐渐下降,由于温度过高会使黄酮类化合物降解,导致酶活性部分丧失,但温度过低不利于黄酮类化合物的溶出[19]。因此,选取提取温度为50 ℃。

图1 提取温度对总黄酮提取量的影响Fig.1 Effect of extraction temperatureon extraction rate of total flavonoids

2.1.2 复合酶比例对总黄酮提取量的影响由图2可知,当果胶酶与纤维素酶的比例为1∶2～1∶1时,总黄酮提取量逐渐增大,并且当复合酶比例为1∶1时,此时长白楤木根总黄酮的提取量最大,为7.1 mg/g,这是由于果胶酶与纤维素酶的比例逐渐增加,其对长白楤木根细胞壁中网状结构破坏力增强,增加了细胞壁通透性,进而溶解流出更多的黄酮类物质,增强了酶促反应速率,使提取量逐渐增加,而在非最佳酶配比溶液中,反而导致酶的作用受到抑制,黄酮的提取量开始降低[20]。因此,选取果胶酶与纤维素酶的比例为1∶1。

图2 果胶酶与纤维素酶的比例对总黄酮提取量的影响Fig.2 Effect of pectinase to cellulase ratioon total flavonoids extraction

2.1.3 提取时间对总黄酮提取量的影响由图3可知,随着提取时间的延长,总黄酮提取量先升高后降低,当提取时间为50 min时,黄酮提取量达最大值6.9 mg/g,之后提取量下降,是由于时间增加,溶液温度略升高,从而导致长白楤木根黄酮提取物有效成分的结构被破坏,发生分解或转化为其他物质[21]。因此,选取提取时间为50 min。

图3 提取时间对总黄酮提取量的影响Fig.3 Effect of extraction timeon extraction rate of total flavonoids

2.1.4 液料比对总黄酮提取量的影响由图4可知,当液料比低于40∶1 (mL/g)时,提取量随着液料比的增大逐渐上升,在40∶1 (mL/g)时达到最大8.2 mg/g,由于溶剂的增加,增大了提取液乙醇与提取物长白楤木根总黄酮的接触面积,使溶出的黄酮类化合物量增大;而液料比在50∶1～70∶1 (mL/g)时,提取量呈现下降趋势,可能由于其它杂质的溶出对总黄酮化合物产生拮抗作用。所以,选择液料比为40∶1 (mL/g)。

图4 液料比对总黄酮提取量的影响Fig.4 Effect of liquid-to-liquid ratioon extraction rate of total flavonoids

2.1.5 乙醇体积分数对总黄酮提取量的影响由图5可知,随着乙醇体积分数的增大,长白楤木根总黄酮提取量呈现上升趋势,当乙醇体积分数为50%时,长白楤木根总黄酮提取量达到最大为7.5 mg/g;当乙醇体积分数为50%～80%时,总黄酮提取量则逐渐减小。由于不同浓度的乙醇溶液极性不同,乙醇体积分数越大,其溶剂极性越小,而黄酮类化合物的极性一般都较小,根据相似相容原理[22],所以乙醇体积分数越高其黄酮提取量越低。因此,选择乙醇体积分数为50%。

图5 乙醇体积分数对总黄酮提取量的影响Fig.5 Effect of ethanol volume fractionon extraction rate of total flavonoids

2.2 响应面试验结果与分析

2.2.1 响应面试验设计与结果分析在单因素试验的基础上,基于Box-Behnken实验设计原理,以长白楤木根总黄酮提取量为响应值,运用Design Expert 8.0.6软件设计响应面实验,固定提取温度为50 ℃,考察果胶酶与纤维素酶的比例(A)、提取时间(B)、液料比(C)、乙醇体积分数(D)间交互作用对长白楤木中总黄酮提取量的影响,因素水平设计见表2。

表2 响应面试验设计与结果Table 2 Response surface test design and results

采用Design Expert 8.0.6软件对表2中的数据进行二次多项式回归分析,结果表明,得到总黄酮提取量对果胶酶与纤维素酶的比例(A)、提取时间(B)、液料比(C)、乙醇体积分数(D)的二次多项回归方程:

总黄酮含量=8.11+0.068A+0.28B-0.080C-0.38D-0.49AB-0.32AC-0.48AD-0.12BC-0.36BD+0.096 CD-1.19A2-1.45B2-1.33C2-2.05D2。

根据响应面设计方案,进行方差分析,见表3。

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

采用Design-Expert 8.0.6软件对复合酶添加量、提取时间、液料比、乙醇体积分数4个因素间交互作用进行响应面分析,得到以总黄酮提取量为响应值的响应面。各因素之间的交互作用对响应值的影响可用响应面图和等高线表示。当响应面图的曲面坡度越陡峭,说明两因素之间交互作用就越大[23],两个因素交互作用的响应面和等高线图,如图6、图7所示,且由表3的方差分析表可知,AB、AD偏回归系数差异显著(P<0.05),说明果胶酶与纤维素酶的比例与提取时间、果胶酶与纤维素酶的比例与乙醇体积分数两两之间的交互作用对长白楤木根总黄酮提取量的影响显著。而等高线是响应面中水平方向的投影,等高线的形状可反映出交互作用的显著性[24]。当等高线趋于椭圆形,表示两因素之间交互作用显著,趋于圆形则恰好相反。由图6、图7等高线图可知,其中果胶酶与纤维素酶的比例和提取时间的交互作用、果胶酶与纤维素酶的比例和乙醇体积分数的交互作用影响显著,这与表3显著性检验结果完全一致。

图6 果胶酶纤维素酶的比例与超声提取时间交互作用的响应面图和等高线图Fig.6 The response surface diagram and contour plot ofthe interaction between the ratio of pectinase and cellulaseand the time of ultrasonic extraction

图7 果胶酶纤维素酶的比例与乙醇体积分数交互作用的响应面图和等高线图Fig.7 Response surface and contour plots ofthe interaction between the ratio of pectinase cellulaseand the volume fraction of ethanol

以总黄酮提取量为评价指标,分析得出响应面法优化长白楤木根总黄酮的最佳工艺条件为:复合酶添加量(质量分数为5%,纤维素酶∶果胶酶=1∶1.2)、提取时间为50.45 min、液料比为40.85∶1 (mL/g)、乙醇体积分数为49.95%,此时总黄酮的提取量为8.6±0.04 mg/g。

2.2.2 验证试验为了实际操作的方便性和可行性,将其改为复合酶比例(质量分数为5%,纤维素酶∶果胶酶=1∶1)、提取时间为50 min、液料比为40∶1 (mL/g)、乙醇体积分数为50%。在此条件下进行3组平行试验验证,实际测得黄酮提取量的平均值为8.6±0.05 mg/g,与预测值8.6±0.04 mg/g相接近,由此可见,该模型可以较好的预测总黄酮的提取量。

2.3 抗氧化性试验

2.3.1 长白楤木根总黄酮对DPPH·的清除能力由图8可知,随着长白楤木根总黄酮浓度的增加,DPPH·的清除作用逐渐增大,质量浓度从0.03～0.15 mg/mL时,长白楤木根总黄酮对DPPH·的清除率从81.1%增加到96.3%,而对照组VC对DPPH·的清除率仅从19.1%增加到78.7%,并且在相同浓度下,与VC相比,长白楤木根总黄酮具有更高的DPPH·清除能力。由此可见,在一定浓度范围内,长白楤木根总黄酮对DPPH·有很好的清除作用。

图8 长白楤木根总黄酮对DPPH·的清除能力Fig.8 DPPH· scavenging ability of total flavonoidsfrom root of Aralia continentalis Kitagwa

2.3.2 长白楤木根总黄酮对·OH的清除率能力由图9可知,随着长白楤木根总黄酮浓度的增加,黄酮提取液的·OH清除能力与质量浓度呈正相关,在黄酮浓度为0.03～0.09 mg/mL时,清除率明显上升,之后呈缓慢上升趋势,与VC相比,长白楤木根总黄酮具有更高的清除·OH的能力。当长白楤木根总黄酮浓度在0.15 mg/mL时,清除率最大为70.1%,而VC清除率最大为36.9%。