响应面优化泡沫法提取辣木叶蛋白工艺

孙劲毅,卢彦轩,惠永海,张世奇,*

(1.岭南师范学院化学化工学院,广东湛江 524048;2.广东省辣木资源开发与利用工程技术研究中心,广东湛江 524048)

辣木(MoringaoleiferaLam),又称鼓槌树、辣根树、奇迹树、生命之树等,原产于非洲和印度的热带、亚热带等地区[1-2],经引种后,目前在我国的广东、广西、海南、云南及台湾等省均有种植。辣木树富含蛋白质、氨基酸、矿物质等营养成分,其根、叶、花、绿荚和种子等均可食用[3],具有较高的营养和药用价值[4]。研究表明,辣木叶是目前已知最好的植物蛋白来源之一,其蛋白质的含量为10.74%～30.29%[5-7]。由于辣木在热带和亚热带地区被广泛种植,因此一些发展中国家将辣木叶作为食品用以解决营养不良和粮食安全等问题[8-9]。辣木叶中的VC、VA、钙、钾、铁和蛋白质的含量均高于橙子、胡萝卜、牛奶、香蕉和酸奶等食品[10-11],且已被用于改善婴儿、孕妇、哺乳母亲的营养不良和增加哺乳期母亲的母乳量等方面[12]。此外,辣木叶作为家畜饲料中蛋白质、抗生素和抗氧化剂等的优质来源,能够改善动物生长性能、肉类氧化稳定性和感官质量[13-15],具有降低肉制品加工和冷藏后微生物生长的速度等作用[16]。

辣木叶蛋白作为优质的植物源蛋白,用何种方法提取这一问题被众多研究者所关注。植物蛋白的提取方法主要有等电点沉淀法[17]、盐析法[18]、酶提法[19]等,但上述方法均存在一定的弊端,诸如酸碱的使用,有机溶剂的大量浪费以及工艺的繁琐等问题,缺少工艺简单、环境友好型的提取方法。针对上述问题,本研究采用泡沫法提取辣木叶蛋白。泡沫法目前主要应用于废水处理,在植物蛋白分离中的研究相对较少,其原理是利用溶液中不同物质表面活性差异对物质进行分离,表面活性强的能够吸附在气液相界面处形成泡沫,而表面活性弱的则停留在溶液中,使泡沫和溶液分离,然后达到分离提取的目的[20]。辣木叶蛋白作为天然的高分子表面活性剂,其具有优良的表面活性能力,因此可以通过搅打、鼓气等方式使蛋白质吸附到气液相交界处进行定向排列,产生大量泡沫,将泡沫收集起来可得到蛋白质溶液[21]。泡沫法运行成本低,工艺简单,在分离过程中不需要大量的有机溶剂,能够有效降低对环境的污染,提取后剩余的水体液及残渣仍可添加在家畜饲料中,因此可用于工业化生产[22]。

本研究以辣木叶为原料,通过单因素试验研究氯化钠浓度、料液比、提取温度对泡沫法提取辣木叶蛋白工艺的影响,在单因素实验的基础上,利用响应面法优化提取工艺并确定最佳工艺,旨在为辣木蛋白资源深度开发与利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

辣木叶 采摘于湛江市佳池塘辣木种植基地;氯化钠、85%磷酸、无水乙醇、考马斯亮蓝G-250、硫酸铜、硫酸钾、硫酸 分析纯,国药集团;牛血清蛋白(标准品) 北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。

SHZ-D3循环水式多用真空泵 巩义市予华仪器有限责任公司;JA3002电子分析天平 上海蒲春计量仪器有限公司;TGL16M医用离心机 盐城市凯特实验仪器有限公司;TU-1810DASPC紫外可见光光度计 北京普析通用有限责任公司;MJ-BL25B3搅拌机 广东美的生活电器制造有限公司;DDQ-B01K1打蛋机 广东小熊电器有限公司;HH-2数显恒温水浴锅 常州荣华仪器制造有限公司;KDN-103F自动定氮仪 上海纤检仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 辣木叶蛋白的提取 参考文献[23]的方法并加以改进,将新采摘的辣木叶洗净后自然晾干,粉碎过100目筛,精确称取5.000 g辣木叶粉,按实验设计条件加入一定浓度和一定体积的氯化钠溶液,在一定温度下浸泡2 h,6000 r/min离心10 min,弃去残渣,按上述条件重复离心两次,收集上清液,在与浸泡温度相同的温度下用打蛋器搅打起泡,收集泡沫至无泡沫产生,静置消泡后得到辣木叶蛋白提取液。

1.2.2 单因素试验 以辣木叶蛋白为考察指标,按照1.2.1的提取方法分别研究氯化钠浓度、料液比、提取温度对辣木叶蛋白得率的影响。

固定料液比为1∶80 g/mL,提取温度为35 ℃,其余条件与1.2.1相同,研究不同浓度氯化钠溶液(0.3%、0.5%、0.7%、0.9%、1.1%)对辣木叶蛋白得率的影响。

固定氯化钠浓度为0.7%,提取温度为35 ℃,其余条件与1.2.1相同,研究不同料液比(1∶20、1∶40、1∶60、1∶80、1∶100 g/mL)对辣木叶蛋白得率的影响。

固定料液比为1∶80 g/mL,氯化钠浓度为0.7%,其余条件与1.2.1相同,研究不同提取温度(25、35、45、55、65 ℃)对辣木叶蛋白得率的影响。

1.2.3 响应面试验设计 在单因素试验的基础上,根据Box-Benhnken设计原理,以氯化钠浓度、液料比、提取温度为响应因素,辣木叶蛋白得率为响应值,设计响应面优化试验。响应面试验的各因素水平见表1。

表1 Box-Behnken设计试验因素水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design experimental

1.2.4 蛋白标准曲线的制作 分别吸取100 μg/mL 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL的牛血清蛋白标准液,加蒸馏水至1.0 mL,再加入5.0 mL 0.1 mg/mL考马斯亮蓝G-250溶液,混合均匀后避光反应5 min;在595 nm的波长处测定各浓度标准液的吸光度,绘制标准曲线,得到回归方程为Y=0.008X+0.0259,其中Y为吸光度值,X为蛋白质的质量浓度(μg/mL),R2=0.9998,说明该方程在蛋白含量为10～60 μg/mL之间的线性关系良好。

1.2.5 辣木叶蛋白得率的测定 测量辣木叶提取液体积,采用1.2.2的方法测定提取液中蛋白的吸光度,并根据回归方程计算提取液中蛋白质的质量浓度。辣木蛋白叶的得率按照下式计算:

式(1)

式(1)中,V为消泡后测得的蛋白质提取液的体积,mL;c为提取液中辣木蛋白的质量浓度,g/mL;M为使用的辣木叶干粉的质量,g。

1.2.6 辣木叶蛋白粉蛋白质含量的测定 将最佳工艺得到的辣木叶蛋白提取液冷冻干燥后得到辣木叶蛋白粉,为了更好的测定蛋白粉中蛋白质的含量,按照国家标准GB 5009.5-2016[24]中的凯氏定氮法对蛋白粉进行测定。

1.3 数据处理

所有实验重复3次,实验结果用平均值±标准差表示,用Origin 9.0、SPSS 25.0和Design-Expert 8.06对实验数据进行处理和分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 氯化钠浓度对辣木叶蛋白得率的影响 由图1可知,当氯化钠浓度为0.9%时,辣木叶蛋白的得率最大。随着氯化钠浓度的增加,辣木叶蛋白的得率先升高后下降。这是由于当氯化钠浓度的增加,蛋白质表面电荷增多,增加了蛋白质在水中的溶解度,因此得率增加,当氯化钠浓度继续增加时,蛋白质表面的双电层和水化层遭到破坏导致蛋白质在水中的溶解性变差,导致蛋白质的得率下降[25]。因此选择氯化钠浓度为0.7%、0.9%、1.1%进行下一步实验。

图1 氯化钠浓度对辣木叶蛋白得率的影响Fig.1 Effect of NaCl concentration on yield ofMoringa oleifera leaf protein注:不同字母表示差异显著P<0.05,图2、图3同。

2.1.2 料液比对辣木叶蛋白得率的影响 料液比对辣木叶蛋白质得率的影响如图2所示。当料液比为1∶60 g/mL时,辣木叶蛋白的得率最大。随着提取液体积的增加,辣木叶蛋白的得率呈现先增大后减小的趋势。这可能是因为当提取液较少时,辣木叶中的蛋白不能完全溶解在提取液中,导致辣木叶蛋白的得率降低;当料液比过大时,提取液中的蛋白质浓度太低,在起泡过程中产生的泡沫稳定性差,不利于泡沫收集,因此蛋白质得率也会降低[26]。因此选择料液比为1∶40、1∶60、1∶80 g/mL进行下一步实验。

图2 料液比对辣木叶蛋白得率的影响Fig.2 Effect of material-liquid ratioon yield of Moringa oleifera leaf protein

2.1.3 提取温度对辣木叶蛋白得率的影响 由图3可知,辣木叶蛋白的得率随着提取温度的增加呈现先上升后下降的趋势,当温度达到35 ℃时,蛋白质的得率最大。随着温度继续升高,蛋白质的得率快速下降。出现这种现象是由于在温度较低时,温度升高有利于蛋白质的溶解,当温度过高时,蛋白质的结构被破坏,因此得率降低[27]。因此选择提取温度为25、35、45 ℃进行下一步实验。

图3 提取温度对辣木叶蛋白得率的影响Fig.3 Effect of temperature on yield ofMoringa oleifera leaf protein

2.2 泡沫法提取辣木叶蛋白响应面优化结果

2.2.1 回归模型的建立与显著性分析 以单因素试验为基础,设计响应面试验优化泡沫法提取辣木叶蛋白工艺,结果见表2。

表2 响应面设计方案和结果Table 2 Response surface designarrangement and experimental results

运用Design-Expert软件进行拟合,得到的回归模型的方程为Y=13.13+0.66A-0.22B-0.97C-0.31AB-0.083AC-0.39BC-3.05A2-0.46B2-1.95C2。

由表3可知一次项A(氯化钠浓度)、C(提取温度)对辣木叶蛋白质得率有极显著的影响(P<0.01),B(料液比)的影响效果显著(P<0.05);二次项A2、C2的影响极显著(P<0.01),B2模型的影响显著(P<0.05);交互项AB、BC影响显著(P<0.05)。模型P<0.0001,说明该模型是极显著的,模型的失拟项P>0.05,表明正常误差在回归方程与实际拟合所占比例小,方程拟合性强。相关系数R2=0.9954,模型推算值与实际值接近,模型拟合度高,试验误差小,可以对试验结果进行准确预测,该模型在统计学上具备现实指导价值。依据F值的大小判断A、B、C三个因素对辣木叶蛋白质得率的影响,由大到小的顺序依次为:C(提取温度)>A(氯化钠浓度)>B(料液比)。

表3 回归模型显著性结果Table 3 Significance test for regression model

2.2.2 响应面图分析 根据响应面分析结果,做出各因素之间的响应面图和等高线图如图4所示。由图4可知,响应值存在最大值,氯化钠浓度与料液比、料液比与提取温度的响应面较陡且等高线呈椭圆形,所以交互作用显著,氯化钠浓度与提取温度的响应面相对平缓,等高线呈圆形,交互效果不显著。

图4 各因素之间交互作用的响应面和等高线图Fig.4 Response surface and counter plots for the effects of experimental factors

2.2.3 验证试验 对回归模型设数据结果进行分析,得到泡沫法提取辣木叶蛋白的最佳提取工艺条件为:氯化钠浓度0.92%、料液比1∶56.35 g/mL、提取温度32.69 ℃,预测辣木叶蛋白得率为13.52%。为了验证该方法的可靠性,同时考虑实际操作情况,将泡沫法提取辣木叶蛋白的工艺修正为:氯化钠浓度0.92%、料液比1∶56 g/mL、提取温度33 ℃,测得辣木叶蛋白得率为13.41%±0.35%,与理论预测值相差0.83%。同其他方法提取辣木叶蛋白相比,熊瑶[28]采用碱提法和微波提取法提取辣木叶蛋白,蛋白质的得率分别为10.7%、10.35%,虽然碱提法和微波提取法的提取时间较短,但由于碱和微波对蛋白质结构产生不同程度的破坏导致两种方法的得率低于泡沫法;黄秋伟等[29]采用超声辅助盐提法提取辣木叶蛋白,其得率为10.28%,该法中氯化钠溶液的最佳浓度为0.7%,提取时间仅为30 min,但所选的最佳提取温度达60 ℃,同时使用具有较高能量的超声波辅助提取,在高温和超声波双重作用下蛋白质极易分解变性,这可能是该法得率低于泡沫法的主要原因。将在此条件下所得辣木叶蛋白提取液冷冻干燥后得到辣木叶蛋白粉,经凯氏定氮法测定可知其中蛋白质的含量为53.94%±0.56%。

3 结论

以氯化钠浓度、料液比、提取温度为变量,辣木叶蛋白为得率为指标,通过单因素和响应面法对泡沫法提取辣木叶蛋白工艺进行优化。结果表明,氯化钠浓度和提取温度对辣木叶蛋白得率的影响极显著(P<0.01),料液比的影响显著(P<0.05),各因素对辣木叶蛋白得率影响的主次顺序为提取温度>氯化钠浓度>料液比。氯化钠浓度与料液比、料液比与提取温度交互作用显著(P<0.05)。经过优化后得到的泡沫法提取辣木叶蛋白的最佳提取工艺条件为盐浓度0.92%、料液比1∶56 g/mL、提取温度33 ℃,此条件下最大得率可达到13.41%±0.35%,所得辣木叶蛋白粉的蛋白含量为53.94%±0.56%。本研究所采用的泡沫法能耗低、污染少且得率较高,能够有效实现辣木叶蛋白的初步分离,为辣木资源的进一步开发提供理论依据。