不同铁皮石斛红鑫品种品质的对比研究

钟淳菲,陈燕兰,任运红,黎 攀,查应洪,杜 冰,*

(1.华南农业大学食品学院,广东广州 510642;2.红河群鑫石斛种植有限公司,云南红河 661200)

铁皮石斛又名铁吊兰、黑节草等,是石斛属药用植物中最为珍稀名贵的一种,早在《神农本草经》和《本草纲目》等医药古籍均有记载。现代医学和药理研究表明,铁皮石斛有多种药理作用,如抗肿瘤[1]、抗衰老、抗疲劳[2]、降低血糖[3]、增强免疫力、改善胃肠道健康[4]、通过抗炎和抗氧化作用减轻学习和记忆障碍等作用[5],因此在民间有“救命仙草”、“中华仙草”的美称。现代药理学研究表明,铁皮石斛含有石斛多糖、氨基酸、黄酮、生物碱及微量元素等多种对人体健康有益的药理成分。

石斛药材属于野生资源,而铁皮石斛对自然生态条件要求极其苛刻,自然繁殖能力低、生长缓慢,自然产量极为稀少,使野生资源濒临绝种,成为“濒危珍稀植物”,被列入《中国植物红皮书》。近年来的过度开采导致野生石斛导致市场供不应求。所以,优质的人工栽培铁皮石斛大大解决了人们的需求。关于石斛品质研究方面,国内已有部分对不同品种、部位、长期、培养方式和干燥方式的石斛多糖、氨基酸、生物碱含量进行了研究,用来评价铁皮石斛的质量。鲁芹飞等[6]比较铁皮石斛和细茎石斛、金钗石斛、马鞭石斛、鼓槌石斛的总多糖、氨基酸、甘露糖含量,结果发现铁皮石斛的总多糖和甘露糖含量远高于其他四种,但氨基酸含量略低于细茎石斛、马鞭石斛和鼓槌石斛。母多[7]比较铁皮石斛、金钗石斛、球花石斛、棒槌石斛、大苞鞘石斛、兜唇石斛的糖类、氨基酸、生物碱含量等指标,结果表明从糖类成分看,铁皮石斛质量最优。

红鑫系列铁皮石斛属于优质品种,目前仅围绕红鑫系列高产人工栽培技术[8]有一些相关研究,然而对于红鑫系列产品的品质研究鲜有报道。此外,铁皮石斛产品的加工工艺很多,其中打浆处理也是铁皮石斛产品开发的一种方式,但打浆对铁皮石斛活性成分的影响未见相关研究报道,石斛浆品质和质构的关系也缺乏相关评价体系。因此,本研究对同产于云南红鑫系列铁皮石斛进行品质对比,同时探究了打浆后石斛品质与质构的关系,以期为石斛品质的快速鉴定提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

红鑫石斛 均由红河群鑫石斛种植有限公司提供,具体的种类、批号及产地见表1;无水葡萄糖标准品 上海士锋科技有限公司;甘露糖标准品、石斛碱标准品 上海江莱科技有限公司;芦丁标准品 广州市齐云生物技术有限公司,均为色谱纯;无水乙醇、硫酸、苯酚、乙腈、甲醇、乙酸铵、三氯甲烷、酚酞、氢氧化钠、盐酸、亚硝酸钠 分析纯,广州化学试剂厂;PMP(1-苯基-3-甲基-5-吡唑咻酮) 分析纯,上海酶联检测技术有限公司。

表1 石斛样品的种类、批号及产地Table 1 Species,batch number andproducing area of dendrobium samples

DGG-924型电热恒温鼓风干燥箱 上海森信实验仪器有限公司;RE-52A旋转蒸发器 巩义市予华仪器有限责任公司;SHZ-D(Ⅲ)型循环水真空泵 上海一科仪器有限公司;HY-5回旋式振荡器 常州澳华仪器有限公司;SC-80C全自动色差仪 北京康光仪器厂;UV5100紫外分光光度计 上海元析仪器有限公司;HH-2数显恒温水浴锅 金坛市鸿科仪器厂;MAT 95XP Thermo型质谱仪 Thermo公司;Krromacil C18制备色谱柱 美国Krromacil公司;LC-20A液相色谱仪、RID-10A示差折光检测器、EZ-Test质构仪 日本(岛津)有限公司;TSKgel G5000PWxl凝胶柱、TSKgel G3000PWxl凝胶柱 东曹达(上海)贸易有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 石斛的处理 将石斛统一进行干燥处理,取新鲜铁皮石斛,洗净、沥干后,于65 ℃热风干燥48 h。并测定其水分含量,石斛干品水分含量约为9.00%±0.5%。

1.2.2 石斛的物性测定 物性的测定均参考文献[9]的操作进行。

1.2.2.1 硬度的测定 选取石斛相同部位,采用EZ-Test质构仪测定其硬度。测试参数为圆柱形探头,平端直径为50 mm;测试前探头下降速度:1.0 mm/s;测试速度:1.0 mm/s;测试后探头回程速度:8.0 mm/s;时间:5.0 s;测试距离:30.0 mm,位移原点:载荷10 gf;试验类型:压缩。每个样品重复10次。

1.2.2.2 剪切力和剪切位移的测定 选取石斛相同部位。使用ALKB切刀对样品进行TPA测试。测试参数为:下压速率、上行速率分别为1和5 mm/s,切割程度为75%,停留间隔为5 s,数据采集速率:400 pps;触发力值:5 kg。最大剪切位移值和变形应力值表征石斛的脆度。每个样品重复10次。

1.2.2.3 粘度与稠度的测定 称取5 g的石斛样品,100 ℃复水5 min,取出沥干后加水打浆(料液比为1∶20)。分别将石斛浆样品置于高度50 cm,直径8.0 cm的待测玻璃杯中,采用EZ-Test质构仪测定其粘度和稠度。测试参数为反挤出试验探头,平端直径为60 mm;测试前探头下降速度:1.0 mm/s;测试速度:8.0 mm/s;测试后探头回程速度:5.0 mm/s;时间:5.0 s;测试距离:30.0 mm;位移原点:载荷10.0 gf;试验类型:压缩。每个样品重复6次。

1.2.2.4 感官评价 对石斛样品清洗干净,10个以上人员进行品尝(准确给出感官评定人员的数量),对石斛的香气、滋味和接受程度等指标进行综合评价。具体评分标准如表2所示。

表2 石斛浆样品的感官评价标准Table 2 Sensory evaluation criteria for dendrobium samples

1.2.2.5 色差值测定 参考文献[10]，称取一定质量(5±0.5) g的石斛浆样品,将不同石斛浆样品分别平铺于带盖的透明塑料皿中,压实,采用色差仪测定色度值L*、a*、b*,每个样品测量3次,取平均值。

1.2.3 活性成分含量测定

1.2.3.1 多糖含量测定 参照2010版《中国药典》[11]测定铁皮石斛多糖含量。

葡萄糖标准曲线的测定:配置浓度为0.01 μg/mL葡萄糖的标准液,精密量取标准液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL,分别置10 mL具塞试管中,各加水补至1.0 mL,精密加入5%苯酚溶液1 mL(临用配制),摇匀,再精密加硫酸5 mL,摇匀,置沸水浴中加热20 min,取出,置冰浴中冷却5 min,以相应试剂为空白,用紫外-可见分光光度在488 nm的波长处测定吸光度,以吸光度为纵坐标,浓度为横坐标,绘制得到葡萄糖标准曲线:y=9.1529x+0.0471,R2=0.9991。

样品溶液的制备:取石斛干粉约0.3 g(过100目筛),用水提醇沉法提取石斛多糖,得石斛多糖提取液。

样品多糖含量的测定:用紫外-可见分光光度在488 nm的波长处测定吸光度,从标准曲线上得出供试品溶液中无水葡萄糖的量,计算,即得石斛多糖含量。

1.2.3.2 多糖分子量测定 石斛多糖分子量的测定采用高效凝胶渗透色谱法[12]测定。

分析条件:色谱柱:TSKgel G5000PWxl与G3000PWxl(7.8 mm×30 cm,Tosoh Bioscience,Stuttgart,Germany)串联使用,最大压力设置为3 MPa。流动相为20 mmol/L 磷酸缓冲液,pH7.0。进样量:20 μL;流速为0.5 mL/min。洗脱时间80 min。

标准曲线的测定:取葡萄糖和8个已知分子量的右旋糖酐标准品(Dextran),重均分子量分别为198、5000、12000、50000、150000、410000、670000、1100000、2290000 Da,分别用20 mmo/L 磷酸缓冲液,pH7.0溶解,制成10 mg/mL的溶液。根据多糖标准品的分子量和色谱图的保留时间,由GPC软件(LCsolution GPC)处理,以保留时间为横坐标,相对分子质量对数值为纵坐标,绘制标准曲线,得回归方程:log(Mw)=-0.1579tR+12.799,Mw为重均分子量,tR为保留时间(min),相关系数r=0.9949。

样品分子量的测定:石斛多糖样品溶液,冷冻干燥后用ddH2O溶解成10 mg/mL溶液,过0.45 μm尼龙膜,取20 μL注入色谱仪,记录色谱图。根据样品的保留时间,与标准曲线对照,用GPC软件计算出多糖分子的分子量。

1.2.3.3 多糖的单糖组分分析 多糖的提取及纯化[13]:石斛样品经过烘干后粉碎,过100目筛,称取50 g石斛粉末,按照料液比1∶20加入蒸馏水,浸泡1 h后置于100 ℃水浴锅回流提取3 h,过滤,滤液加入5倍体积的无水乙醇,振荡摇匀,冷藏1 h,4000 r/min下离心20 min,收集沉淀物,再用80%的乙醇洗涤2次,离心,弃去上清液,沉淀物经冷冻干燥即得石斛粗多糖样品。

石斛粗多糖样品再经过SephadexG-50葡聚糖凝胶色谱柱进一步纯化,收集第101～275 mL淋洗液于60 ℃水浴烘干,得纯化的石斛多糖[14]。

多糖的水解及乙酰化:取500 mg纯化的石斛多糖,加入2 mol/L H2SO438 mL加热回流6 h,冷却,用饱和Ba(OH)2溶液中和至中性,过滤,滤液彻底蒸干水分后,加入70 mg盐酸羟胺和5 mL吡啶,于90 ℃水浴加热1 h,取出稍冷,加入5 mL醋酸酐,再于90 ℃水浴加热1 h,冷却,加10 mL水破坏醋酐,用氯仿萃取乙酰化产物,氯仿萃取液用水洗涤,无水硫酸钠脱水,上清液通氮气浓缩定容至1 mL,进行GC-MS分析。

GC-MS条件:SE-30弹性石英毛细管柱(15 m×0. 2 mm×0. 33um),柱温初温100 ℃,以10 ℃/min程序升温至280 ℃,保持10 min,载气He。柱前压70 kPa,分流比10∶1,溶剂延迟2 min,进样量1.0 μL。EI离子源,电子能量70 eV,四极杆温度150 ℃,离子源温度230 ℃,电子倍增器电压2300 V,GC-MS接口温度280 ℃,质量扫描范围29～500 m/z。

1.2.3.4 黄酮类物质含量的提取与测定 参考文献[15]的方法。芦丁标准曲线的测定:配置浓度为0.2 mg/mL的芦丁标准液,准确吸取0.2 mg/mL芦丁溶液0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mL,分别置于比色皿中,用蒸馏水代替芦丁溶液为零管,各加水至2.4 mL,分别加入5% NaNO2溶液0.4 mL,摇匀,静置6 min;加入4% NaOH溶液4 mL,摇匀,静置15 min;在510 nm处测定吸光度,以吸光度为纵坐标,芦丁含量为横坐标绘制得标准曲线:y=0.98x+0.0008,R2=1。

样品溶液的制备:准确称取2.0 g石斛干粉(60目筛),置于索氏提取器中,加入乙醇回流提取1 h,过滤。光照去叶绿素,用乙醇定容。

样品中总黄酮含量的测定:精确吸取样品溶液1.0 mL,置于10 mL容量瓶中,按照标准曲线项下操作,每个样品平行测定3次,测得的吸光度代入芦丁标准曲线方程中,计算石斛中总黄酮的含量采用醇沉法提取石斛样品,光照去叶绿素后,测定其吸光度并代入标准曲线进行计算得出黄酮含量。

1.2.3.5 生物碱含量测定 参考文献[16]的方法。标准曲线的测定:精密称取石斛碱1.00 mg,置100 mL容量瓶中,加氯仿至刻度。精密量取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL分别置分液漏斗中,用氯仿准确稀释至10.0 mL,加入pH4.5缓冲溶液5.0 mL和0.04%溴甲酚绿溶液1.0 mL,剧烈振摇3 min,静置30 min,氯仿层通过经氯仿浸泡处理并干燥后的药棉滤过,取续滤液6.0 mL,加0.01 N氢氧化钠无水乙醇液1.0 mL,摇匀,以氯仿10.0 mL,同样操作,做空白对照。于波长620 nm处分别测得吸光度值,以石斛碱量为横坐标,吸光度为纵坐标绘制得石斛碱标准曲线:y=0.0084x+0.0013,R2=0.9983。

样品溶液的制备:精密称取0.5 g石斛干粉(60目筛),用适量氨水湿润,密塞放置30 min,精密加入氯仿10.0 mL,称重,置水浴上加热回流2 h,冷却后称重,补充氯仿达原重,过滤,精密量取续滤液1.0 mL,置10 mL容量瓶内,加氯仿至刻度线,摇匀,从中吸取2.0 mL置25 mL容量瓶中,加氯仿稀释至刻度,摇匀,作为样品液。

样品中生物碱含量的测定:精密量取样品液10 mL,按“标准曲线”项下测定其吸光度,每个样品平行测定3次,计算石斛中生物碱的含量。采用氯仿回流制备样液,通过测定其在620 nm处的吸光度值,并代入标准曲线进行计算得出生物碱的含量。

1.3 数据处理

应用SPSS 21.0数据处理系统、Excel 2013、GPC软件(LCsolution GPC)进行试验数据输入、分析和制图。结果采用GPC软件计算多糖分子的分子量,用单因素方差分析法进行品种间差异性比较,用相关系数、偏回归系数进行分析。

2 结果与分析

2.1 三种石斛的物性及活性成分含量分析

2.1.1 三种石斛干品的水分含量及质构的差异 由表3可以看出,三种石斛样品经同样方法干燥处理后,水分含量相近,无显著性差异。红鑫1号红杆铁皮石斛的硬度最大,其次是红鑫1号青杆,最小的是红鑫5号,且硬度大小存在显著性差异。三种石斛样品剪切力从大到小为:红鑫1号青杆>红鑫1号红杆>红鑫5号,而剪切位移无显著性差异。

表3 三种石斛干品的水分含量及质构的测定结果Table 3 Determination of water content and texture of three dendrobium stem products

2.1.2 三种石斛浆粘稠度、色泽、感官评分的差异 由表4可知，石斛浆的粘度与其所含成分有关,石斛中的粘性多糖含量越高,多糖分子内部聚合在一起的概率越大,分子间的相互作用力产生使粘度增大[17]。由表4可知,一同产自云南屏边的不同品系的铁皮石斛中,红鑫1号青杆、红鑫1号红杆、红鑫5号的粘度相近,都在0.45～0.49 J之间,三者粘度没有显著性差异。石斛浆的稠度越小,流动性越好,稠度越大,流动性越差。红鑫1号红杆的流动性较红鑫1号青杆差,红鑫5号石斛浆流动性最好。

表4 石斛复水打浆后的物性测定结果Table 4 Determination of physical properties of dendrobium after rehydration and pulping

这三个石斛浆样品中,红鑫5号的亮度最大。三个样品石斛浆颜色偏黄绿色,其中红鑫1号青杆颜色最深,红鑫1号红杆颜色最浅。红鑫1号红杆的感官评价总分最高,其次是红鑫5号,红鑫1号青杆的总分最低,三个品种的石斛浆的稠度、亮度和感官评分均存在显著差异。姜波等[18]对浙江、云南、江苏等地的铁皮石斛进行感官评价,结果显示3种铁皮石斛粘度与稠度差异较明显。

2.1.3 三种石斛干品的活性成分含量 由表5可知，这3个石斛样品中黄酮、生物碱、多糖含量均无显著性差异。其中多糖含量最高为产自红鑫1号红杆,达27.64%,其次为红鑫1号青杆,达25.96%,而红鑫5号的多糖含量最低,为25.70%。根据药典规定铁皮石斛中多糖含量不得少于25.0%,本试验中均符合此标准的样品。谢鲁灵枫等[19]对不同产地铁皮石斛主要成分及甲醇提取物HPLC指纹图谱研究,其中来自云南昆明的铁皮石斛多糖含量为39.08%,总黄酮含量为0.071%,多糖含量较本试验红鑫铁皮石斛含量高,总黄酮含量较本试验结果低。Wang等[20]对不同来源铁皮石斛及其混淆品多糖含量进行了比较,其中4种产于云南的铁皮石斛多糖含量在32.23%～47.17%之间,均比本试验的红鑫铁皮石斛含量高。铁皮石斛总生物碱含量较低,一般在0.0083%～0.0241%之间[21]。本试验结果除中红鑫1号红杆生物碱含量未检出,红鑫1号青杆与红鑫5号生物碱含量处于正常范围。

表5 石斛干品的活性成分含量的测定结果Table 5 Determination of active components of dry dendrobium

2.2 三种石斛的多糖成分评价

2.2.1 三种石斛多糖的分子量及单糖组成

2.2.1.1 多糖分子量及其分布 由表6可知,3种石斛多糖色谱峰的保留时间在44.927～46.101 min之间。3种石斛样品多糖分子量及其分布有明显的差异。而三种铁皮石斛中,分子量从大到小为红鑫1号青杆>红鑫1号红杆>红鑫5号,华允芬等[12]利用高效凝胶色谱法测定铁皮石斛中多糖的重均分子量,为128 kDa,在本试验结果的范围内。

表6 3种石斛样品多糖平均分子量及分布情况Table 6 Average molecular weight and distribution of polysaccharides from three dendrobium species

多糖的均一性与其分子量的分布相关,多糖的均一性在一定程度上与其多分散性系数(D)有关。铁皮石斛多糖分子量的分布系数D较大,均大于2,S15的分布系数达4.45。说明铁皮石斛的多糖非均一组分,是杂多糖。

2.2.1.2 多糖的总离子流图与单糖组成和含量 有研究表明,通过多糖凝胶电泳法建立铁皮石斛主要成分多糖的指纹图谱,不仅可以区分不同地区的铁皮石斛,也可鉴定不同种类的石斛[22]。

图1 3种石斛多糖的GC-MS总离子流色谱图Fig.1 GC-MS Tic of three dendrobium species

由图2可知,不同品种的红鑫铁皮石斛单糖组成种类相近,但含量存在差异。它们的甘露糖绝对峰面积范围在9.30×105～4.87×107之间,其中红鑫1号红杆、甘露糖绝对峰面积最大,在4.0×107以上,甘露糖含量达46.71%。最小的是红鑫1号青杆,甘露糖含量为35.92%。3种石斛样品的单糖组成相近,都是一种酸性杂多糖,主要由4种六碳糖(甘露糖、葡萄糖、半乳糖、鼠李糖)和3种五碳糖(核糖、阿拉伯糖、木糖)组成,其中甘露糖和葡萄糖含量最高,其次是阿拉伯糖。

图2 3种石斛的单糖组成及其相对含量Fig.2 Monosaccharide composition and relativecontent of three dendrobium species

李龙囡等[23]用高效液相色谱法测定了云南瑞丽品种铁皮石斛中甘露糖的含量,为26.32%,甘露糖含量较高,相对品质较好,低于本试验中红鑫系列铁皮石斛。宾宇波等[24]对铁皮石斛多糖进行高效液相色谱分析得出,铁皮石斛多糖由D-甘露糖、L(+)-鼠李糖和D-葡萄糖三种单糖组成。Luo等[25]对铁皮石斛多糖组分结构进行了分析,单糖组成为甘露糖、葡萄糖、阿拉伯糖及微量的半乳糖醛酸,其物质的量之比为6.2∶2.3∶2.1∶0.1。本试验分析红鑫铁皮石斛多糖的单糖组成,发现其由7种单糖组成。

2.3 三种石斛的质构与多糖含量的相关性分析

2.3.1 干石斛的质构-多糖含量的相关性分析 由表7的相关性表明,石斛多糖含量与其硬度呈显著正相关。说明干品石斛多糖的含量与其质构有关,多糖含量越高,石斛的硬度越大。

表7 石斛多糖含量与质构的相关性分析Table 7 Correlation analysis of polysaccharidecontent and texture of dendrobium

2.3.2 石斛浆的质构-多糖的相关性分析 对石斛浆的质构、感官评分与其多糖含量做相关性分析,由表8的相关性表明,石斛浆多糖含量与其稠度呈正相关。石斛多糖含量越高,质越重,嚼之越有粘性,质量更优[26]。石斛浆多糖含量与其粘度滋味、感官评分的相关性也不显著,但感官评分与其滋味呈极显著正相关。由此说明石斛浆的多糖含量与其质构、感官品质没有明显的相关性。

表8 石斛浆质构-多糖-感官评价的相关性分析Table 8 Correlation analysis of the texture-polysaccharide-sensory evaluation of Caulis dendrobii pulp

以多糖为Y值,滋味、稠度、粘度、感官总分为自变量,对其做多元回归方程发现,滋味、稠度、粘度、感官总分这4个自变量对石斛浆多糖含量的影响都不显著(P>0.05),而且以此建立的多元回归方程拟合程度不高,模型不显著(P>0.05)。因此对粘度、稠度等质构指标与多糖含量进行逐步回归分析,得最优回归方程为:

Y=21.485+5.672X1+1.896X2

式中:X1为石斛的粘度,X2为石斛的稠度。它们与多糖含量的多元相关在α=0.05水平显著(P<0.05)。由偏回归系数分析可知,对石斛多糖含量影响最大的因素是粘度,稠度次之。

3 结论

本研究对高产的铁皮石斛红鑫系列品种进行了品质对比研究,结果表明:同产地、同系列、不同红鑫品种的铁皮石斛品质存在显著性差异,红鑫1号红杆在感官综合评分、多糖含量、单糖组成上优于红鑫1号青杆、红鑫5号,为红鑫系列铁皮石斛的进一步利用提供了理论依据。然而,本文仅补充了云南屏边三个红鑫系列铁皮石斛的研究数据,而未对其他品种的石斛植物进行研究对比。我国石斛品种众多,大多数成分还未有质量控制方法,后续研究可以通过对比多品种的品质差异,建立石斛中主要成分的质量评价技术。