高强度间歇运动激活β-catenin通路延缓小鼠绝经后骨量丢失

林甲换 赵必允 夏臣杰

1 宁波城市职业技术学院（浙江宁波315100）

2 宁波市鄞州区中西医结合医院（浙江宁波315101）

3 浙江中医药大学（浙江杭州310053）4 宁波医疗中心李惠利医院（浙江宁波315041）

绝经后骨质疏松症（postmenopausal osteoporosis，PMOP）是一类以骨量流失，骨微结构异常导致骨骼脆性增加的代谢性疾病。高强度间歇运动（high intensity interval exercise，HIIE）是一种多次短时间高/低强度间隔的运动方式。临床研究表明，运动具有加速骨质形成，提升骨量储备，能有效干预PMOP[1]。HIIE 作为常见的运动处方之一，其干预PMOP 的分子机制尚不清楚。

经典Wnt/β-catenin信号通路在骨形成及骨稳态平衡维持起到重要作用，其过表达或缺失会导致骨量的激增或骤降[2，3]。深入研究发现，β-catenin 信号通路具有调控间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）分化的作用，该通路激活后能够促进MSCs 成骨分化，进而改善骨量丢失，是治疗骨质疏松症的潜在靶点[4，5]。本实验通过HIIE干预去卵巢骨质疏松小鼠模型，探讨HIIE 干预小鼠PMOP 的疗效，并进一步探讨其对βcatenin信号通路的影响。

1 材料与方法

1.1 动物

雌性10 周龄C57BL/6 小鼠30 只，体重为20 g 左右，由宁波大学动物实验中心提供。小鼠饲养在湿度为40%± 5%、温度为23± 2℃、昼夜12小时更替的环境下，可自由饮水和进食。

1.2 药物及试剂

戊巴比妥粉（中生瑞泰科技有限公司，中国），4%多聚甲醛（Solarbio 公司，中国），阿尔新蓝/苏木精（Alcian blue/ hematoxylon，ABH）染液（Sigma 公司，美国），Orange G 染液（Sigma 公司，美国），Triton X-100（Sigma公司，美国），柠檬酸钠缓冲液（中杉金桥生物技术有限公司，中国），一抗：β-链蛋白（β-catenin）（Abcam，美国），Runt 相关转录因子2（Runx2，Abcam，美国），碱性磷酸酶（ALP，Arigo，中国），IgG-HRP二抗（中杉金桥生物技术有限公司，中国）。

1.3 主要仪器

小鼠跑步仪（Mouse Specifics 公司，美国），蔡司显微镜（Zeiss公司，德国），Micro-CT（Skyscan 1170，Bruker 公司，比利时），骨形态计量仪（Osteometrics 公司，美国）。

1.4 小鼠造模[6]及分组

腹腔注射0.3%戊巴比妥（0.1 ml/10 g）麻醉后，常规备皮，皮肤消毒，于背部正中线做长约1.5 cm 的切口，沿两侧背部肋弓缘、腰椎旁逐层进入腹腔，暴露两侧卵巢及输卵管。其中模型组和运动治疗组各10只，去除双侧卵巢及结扎输卵管；假手术组10 只，去除双侧卵巢周围的等量脂肪组织。检查腹腔无活动性出血后，缝合切口，并于术后连续3d 腹腔注射青霉素。假手术组和模型组小鼠常规自由饲养，治疗组在此基础上按既定方案进行运动干预。

1.5 运动干预方案

造模手术后，常规饲养观察3 天，第4 天起进行运动干预。运动治疗组小鼠置于小鼠跑步仪上，并按如下参数进行每天30 min 高强度间歇运动（5 m/min 步行60 s，间隔25 m/min 快跑30 s）[7]。整个持续运动干预时间持续8周。

1.6 微型计算机断层扫描（micro computed tomogra⁃phy，Micro-CT）扫描分析

各组小鼠安乐死后，取双侧股骨远端，剔除周围软组织，置于Micro-CT 进行扫描及三维重建。扫描参数为：分辨率4000×2672，铝板0.2 μm，扫描层厚为10 μm。检测参数有：骨密度（BMD）、骨体积分数（BV/TV）、骨小梁数目（Tb.N）、骨小梁厚度（Tb.Th）和骨小梁间距（Tb.Sp）。

1.7 样本制作

各组小鼠安乐死后，取双侧股骨远端，剔除周围软组织，PBS清洗后置于4%多聚甲醛中固定72 h。固定后的组织进行脱钙、脱水及石蜡包埋，并将其制作成3 μm厚度的石蜡切片。

1.8 阿尔新蓝/苏木精（Alcian blue/ hematoxylon，ABH）染色及定量分析

脱蜡复水完成后，将切片置于ABH 染液染色1 h。0.3%盐酸酒精分化、1%氨水返蓝后，置于Orange G染液浸洗1 min。纯水清洗，酒精梯度脱水，二甲苯透明，透明树脂封片。使用骨形态计量仪对染色后的切片进行组织形态定量分析，包括骨小梁面积分数（%）、脂肪空泡面积比（%）和脂肪空泡直径（μm）。

1.9 免疫组化检测及定量分析

脱蜡复水完成后，将切片浸入柠檬酸钠缓冲液60°修复4 h。PBS清洗后，浸于0.3%的Triton X-100溶液10 min，内源性过氧化氢酶封闭20 min，分别滴加β-链蛋白（β-catenin）及其下游成骨蛋白Runt相关转录因子2（runt-related transcription factor 2，Runx2）和碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）一抗溶液，于4℃孵育过夜。PBS 清洗后，滴加IgG-HRP 二抗孵育20 min，DAB 液体显色5 min，苏木素复染细胞核。纯水清洗，酒精梯度脱水，二甲苯透明，透明树脂封片。β-catenin，Runx2 和ALP 蛋白表达阳性时呈现棕色。在蔡司显微镜下随机选取切片上的4个区域，使用Image-Pro Plus 软件（Media Cybernetics，美国）对上述蛋白的阳性表达进行平均光密度值（IOD/Area）的定量分析（每个组至少检测3个不同样本组织切片）。

1.10 统计学方法

所得实验数据均用平均数±标准差（±s）来表示。采用SPSS 20.0统计学软件进行单因素方差（oneway ANOVA）分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 高强度间歇运动延缓PMOP小鼠骨量丢失

Micro-CT 三维重构图及骨微结构分析结果显示（图1，表1）：造模8周后，与假手术组相比，去卵巢后模型组股骨远端骨微结构破坏，骨密度下降，骨小梁稀疏，数量减少，骨小梁间距增大（P＜0.05），提示去卵巢PMOP 小鼠模型成功建立；与模型组比较，HIIE治疗组小鼠骨密度、骨体积分数、骨小梁数目和骨小梁间距等参数均显著改善（P＜0.05），提示HIIE 能够有效延缓PMOP小鼠骨量丢失和骨微结构破坏。

图1 小鼠股骨远端三维重构图

表1 小鼠骨微结构参数比较（±s）

表1 小鼠骨微结构参数比较（±s）

BMD：骨密度；BV/TV：骨体积分数；Tb.N：骨小梁数目；Tb.Sp：骨小梁间距；Tb.Th：骨小梁厚度。* P＜0.05，与假手术组比较；#P＜0.05，与模型组比较

Tb.Th（mm）0.12± 0.01 0.11± 0.01 0.11± 0.03组别（n=10）假手术组模型组运动治疗组BMD（mg/mm3）1.20± 0.08 0.94± 0.08 *1.14± 0.11#BV/TV（%）40.10± 6.15 27.50± 3.74 *35.14± 4.26#Tb.N（N/mm）3.41± 0.43 2.46± 0.28 *2.67± 0.16 *#Tb.Sp（mm）0.20± 0.04 0.32± 0.07 *0.27± 0.02 *#

2.2 高强度间歇运动改善PMOP小鼠股骨远端骨髓腔结构

小鼠股骨远端病理组织切片经ABH 染色后，骨小梁呈橘色，骨髓细胞呈紫色和脂肪空泡呈白色（黑色三角形标记处）。ABH 染色及骨组织形态计量分析结果显示（图2，表2）：与假手术组比较，去卵巢后模型组骨小梁结构稀疏，髓腔内骨髓细胞排列紊乱及大量脂肪空泡堆积，脂肪空泡平均直径显著增加（P＜0.05）；HIIE治疗组骨小梁增粗，髓腔内骨髓细胞数量增多且排列有序，脂肪空泡面积及直径显著减小（P＜0.05）。

图2 小鼠股骨ABH病理染色（×100）

表2 小鼠骨组织形态计量分析（±s）

表2 小鼠骨组织形态计量分析（±s）

* P＜0.05，与假手术组比较；# P＜0.05，与模型组比较

组别（n=10）假手术组模型组运动治疗组脂肪空泡直径（μm）23.22± 1.90 32.03± 5.62 *25.43± 3.91 *#骨面积分数（%）22.49± 2.21 13.08± 5.96 *19.62± 5.71#脂肪空泡面积比（%）3.03± 0.66 13.01± 4.95 *6.96± 3.58 *#

2.3 高强度间歇运动促进β-catenin 及其下游成骨蛋白表达

为明确HIIE 延缓骨量流失及改善骨微结构的分子作用机制，各组小鼠股骨远端病理组织切片进行免疫组化染色，并对阳性染色（棕黄色，黑色箭头标记处）进行平均光密度值（IOD/Area）量化分析。免疫组化及定量结果显示：假手术组β-catenin 蛋白及其下游的成骨蛋白Runx2 和ALP 集中表达在生长板及软骨-骨移行交界区软骨细胞。目前，该群细胞已被证实具有MSCs 特性，能够持续分化为成骨细胞发挥成骨作用，是机体骨稳态维持的重要组成部分[8]。与假手术组比较，模型组生长板和软骨-骨移行交界区MSCs 的βcatenin、Runx2 和ALP 蛋白表达显著下降（P＜0.05）；与模型组比较，HIIE 干预8 周后，相应区域MSCs 的βcatenin、Runx2和ALP蛋白表达明显改善（P＜0.05）。

图3 股骨β-catenin、Runx2及ALP蛋白表达比较（×100）

表3 β-catenin、Runx2及ALP蛋白定量分析（IOD/Area）（±s）

表3 β-catenin、Runx2及ALP蛋白定量分析（IOD/Area）（±s）

* P＜0.05，与假手术组比较;# P＜0.05，与模型组比较

组别（n=10）假手术组模型组运动治疗组ALP 0.032± 0.005 0.012± 0.003*0.026± 0.006*#β-catenin 0.072± 0.017 0.020± 0.005 *0.047± 0.010 *#Runx2 0.058± 0.011 0.016± 0.004*0.033± 0.008*#

3 讨论

PMOP是一类与MSCs分化异常密切相关的代谢性疾病。MSCs具有自我更新及多向分化的潜能，其正常的成骨分化在维持骨稳态环境中起关键作用[9]。研究发现，除了常见的骨髓间充质干细胞（BMSCs）外，生长板软骨细胞也具有MSCs 特性，能够进行成骨分化，是机体骨形成的重要组成部分。MSCs 表面表达有雌激素受体，能够特异性与雌激素结合，并促进其向成骨细胞分化，抑制其向脂肪细胞分化[10]。绝经后，雌激素分泌显著下降，引起MSCs成骨-成脂分化异常，导致骨稳态失衡，是PMOP的重要细胞学发病机制。

运动作为一种治疗方式，被世界卫生组织（WHO）推荐为抗骨质疏松症非药物治疗的首选方案[11]。临床上，不同的运动处方广泛应用于骨质疏松症的预防和治疗。与其他运动方式（如中等强度的持续运动）相比，HIIE可更好地延缓PMOP患者的骨量丢失，增加骨密度。研究发现，HIIE 能以合理的生物力学刺激作用于力负荷感受器（骨细胞），经细胞外基质转导至MSCs，进而影响其成骨-成脂分化[7]。

然而，MSCs 分化调控是一个复杂过程，受到多个层面的因素影响，如胞内、胞外信号转导、DNA 转录及转录后修饰等，多个信号通路可参与其中。β-catenin作为肌肉骨骼分子开关，能够决定MSCs 分化命运[12]。经典Wnt信号通路中，Wnt配体通过与细胞膜表面受体Frizzled 和LRP5/6 结合后，募集Disheveled 和Axin，致使GSK3β-Ckl-Axin-APC 四聚体结构解聚，失去磷酸化β-catenin 的功能，导致胞浆内β-catenin 增多，经跨核膜转运与LEF1/TCF结合后，激活下游成骨靶基因表达。研究发现，体外抑制MSCs 的β-catenin 基因，会导致其成骨分化和骨矿化形成能力下降[13]。体内利用Cre-Loxp系统在MSCs内条件性敲除β-catenin基因，小鼠出现骨量丢失、髓腔内大量脂肪细胞堆积等MSCs异常分化的表型[14]。这提示，β-catenin 信号通路可能是HIIE影响MSCs成骨分化的重要调控机制。

本实验采用成熟的去卵巢小鼠模型模拟妇女绝经后的生理状态。Micro-CT 结果显示造模后8 周，模型组小鼠骨量较假手术组明显下降，骨微结构破坏，表明PMOP 小鼠模型成功建立。运动干预延缓PMOP 小鼠骨量丢失，显著改善了去卵巢小鼠的骨量及骨微结构。组织病理层面，造模组骨小梁稀疏，大量脂肪空泡堆积，HIIE 运动治疗后，脂肪空泡数量显著减少，并且被正常的骨髓细胞及骨小梁结构替代，提示去卵巢造模后，存在MSCs 成骨-成脂分化异常，而HIIE 能够影响MSCs 向成骨细胞分化，进而延缓小鼠骨量丢失。Runx2和ALP是Wnt/β-catenin信号通路下游成骨靶基因，其中Runx2是MSCs成骨分化的特异性转录调节因子，ALP具有促进羟磷灰石沉积，能够反映成骨形成能力。免疫组化结果显示，去卵巢造模后MSCs 的βcatenin 及下游Runx2 和ALP 蛋白表达明显减少，导致MSCs成骨分化减弱，骨形成能力下降，是引起PMOP小鼠骨量流失和骨微结构破坏的潜在分子机制。HIIE能够激活β-catenin 信号通路，促进下游的Runx2 和ALP靶基因的表达，影响MSCs成骨-成脂分化，延缓去卵巢引起的小鼠骨量流失和骨微结构破坏。

4 结论

高强度间歇运动可能通过激活β-catenin信号通路及下游Runx2、ALP 成骨基因表达，进而调控干细胞成骨分化，干预小鼠绝经后骨质疏松症。