高效液相色谱法筛查利肺片中南五味子代替五味子

张永萍，李永鹏

（1.青海省海东市食品药品和质量技术检验检测中心，青海 海东 810600； 2.青海省药品检验检测院，青海 西宁 810000）

五味子为木兰科植物五味子 Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.的干燥成熟果实，习称北五味子，而南五味子为木兰科植物华中五味子 Schisandra sphenanthera Rehd.et Wils.的干燥成熟果实[1]。南北五味子功效相似，但来源不同，且五味子市场价格明显高于南五味子，一般认为五味子的品质优于南五味子。利肺片处方规定投料为五味子，其现行质量标准中以两者共有成分五味子甲素为鉴别指标，难以反映投料情况[2]。南五味子中五味子酯甲含量远高于五味子[3-5]。本研究中对利肺片五味子药材的投料情况进行筛查，采用高效液相色谱(HPLC)法测定利肺片中五味子醇甲和五味子酯甲的含量[6-10]，并以五味子酯甲峰面积和五味子醇甲峰面积的比值(R值)判断产品是否有南五味子投料。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters 2695型高效液相色谱仪（包括二极管阵列检测器，美国沃特世公司）；Milli-QA10型超纯水器（德国默克密理博公司）；BSA224SCW型电子天平（赛多利斯公司，精度为十万分之一）；N-1001型旋转蒸发仪（东京理化机械株式会社）；KQ-500DE型超声波清洗器（江苏昆山市超声仪器有限公司，功率为250 W，频率为 20 kHz）。

1.2 试药

五味子醇甲对照品（批号为110857-200406），五味子酯甲对照品（批号为111529-200503），均由中国食品药品检定研究院提供；甲醇（色谱纯，默克公司）；水为Milli-Q纯化水；37批利肺片（14个厂家，共37批次）均由2017年国家评价性抽验抽样所得；利肺片模拟制剂（自购药材，经检验符合《中国药典》标准，按处方工艺提取所得）；五味子和南五味子药材各10批，自购药材，经青海省药品检验检测院刘亚蓉主任药师鉴定为木兰科五味子 Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.的干燥成熟果实，南五味子为木兰科华中五味子 Schiscandra sphenanthera Rehd.et Wils.的干燥成熟果实，符合《中国药典》标准。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：依利特 C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇（A）-0.1% 甲酸（B），梯度洗脱（0～10 min时 30%A，10～65 min时 30%A→80%A，65～70 min时80%A→95%A，70～75 min时 95%A→15%A）；流速：1.0 mL ／min；检测波长：250 nm；柱温：30 ℃。理论板数按五味子醇甲峰计不低于3 000。

2.2 溶液制备

取五味子醇甲与五味子酯甲对照品适量，精密称定，加甲醇制成质量浓度分别为 28.4 μg／mL 和 40.1 μg／mL的混合对照品溶液。取样品20片，除去包衣，研细，取约1 g，精密称定，置100 mL具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20 mL，称定质量，超声处理30 min，取出，放冷，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。分别取五味子药材粉末、南五味子药材粉末各1 g，精密称定，分别置100 mL具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20 mL，称定质量，超声处理30 min，取出，放冷，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得药材溶液。按利肺片处方比例和工艺制备不含五味子的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

专属性试验：精密量取2.2项下混合对照品溶液、供试品溶液、阴性对照品溶液，按拟订色谱条件进样测定，记录色谱图。结果阴性无干扰，表明方法专属性良好。色谱图见图1。

线性关系考察：精密吸取2.2项下混合对照品溶液2，5，10，15，20 μL，按拟订色谱条件进样测定。以进样量（X，μg）为横坐标、峰面积积分值（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程，五味子醇甲为 Y醇＝2 083 329.785 7 X醇+15 733.935 2（r＝ 0.998 7），五味子酯甲为 Y酯＝1 571 706.640 2 X酯+16 799.543 3（r＝0.999 0）。结果表明，五味子醇甲和五味子酯甲质量浓度分别在 0.056 8 ～ 0.568 0 μg 和 0.080 2 ～0.802 0 μg范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：精密吸取2.2项下混合对照品溶液10 μL，按拟订色谱条件连续进样测定6次，计算峰面积。结果五味子醇甲平均峰面积为580 572、RSD为0.74% （n＝6），五味子酯甲平均峰面积为 634 112、RSD为0.72%（n＝6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取样品（吉林百姓堂药业有限公司，批号为 20150901）适量，依法制备供试品溶液，于 0，4，8，12，24 h时按拟订色谱条件进样测定，记录峰面积。结果五味子醇甲平均峰面积为 710 018、RSD 为 0.92（n＝6），五味子酯甲平均峰面积为84489、RSD为0.79%（n＝6），表明供试品溶液在24 h内稳定。

图1 专属性试验高效液相色谱图

重复性试验：取同一批样品（吉林百姓堂药业有限公司，批号为20150901）6份，依法平行制备6份供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定。结果五味子醇甲含量为 0.724 7 mg／g、 RSD 为 0.60（n ＝6），五味子酯甲含量为 0.102 7 mg／g、RSD 为 1.81% （n ＝6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取已知含量样品（吉林百姓堂药业有限公司，批号为 20150901，五味子醇甲含量为0.721 6 mg ／g，五味子酯甲含量为 0.102 2 mg ／g）约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入五味子醇甲对照品溶液（360 μg／mL）和五味子酯甲对照品溶液（52 μg ／mL）0.8，1.0，1.2 mL，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定，并计算回收率。结果见表1。

2.4 R值测定及评价

分别取五味子药材和南五味子药材各10批，依法制备药材溶液；分别取五味子投料模拟制剂和南五味子投料模拟制剂各10批，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定，分别记录五味子酯甲和五味子醇甲的峰面积，计算R值。药材和模拟制剂的R值分布图见图2。采用SPSS19.0软件进行数据分析，结果五味子、南五味子的R值分别为 0.025～0.043 和 16.516～32.115；利肺片五味子投料和南五味子投料模拟制剂的R值分别为0.011～0.040 和 19.260～29.995。方差分析检验结果显示，五味子和南五味子R值有显著性差异（P＜0.006）。因此，R＜0.10可作为五味子和南五味子在利肺片中投料的鉴别依据。结果显示，14个企业37批次利肺片样品R值在 0.007 ～0.099 之间，均小于 0.10。可见，样品基本不存在以价格比较低廉的南五味子代替五味子投料现象。

表1 加样回收试验结果（n＝6）

图2 药材和模拟制剂的R值分布图

2.5 含量测定及结果评价

对37批次样品分别进行五味子醇甲和五味子酯甲含量测定，结果见表2。可见，不同批次的五味子醇甲和五味子酯甲含量有一定差异。五味子醇甲含量范围为0.424 7 ～1.490 2 mg／g，平均 0.789 6 mg／g；五味子酯甲含量范围为 0.0014 ～0.0666 mg／g，平均 0.0261mg／g。

3 讨论

试验中使用二极管阵列检测器在200～400 nm波长范围内扫描，发现五味子醇甲与五味子酯甲波长在（250±2）nm范围内均有最大吸收。故选择250 nm波长为检测波长。

表2 37批次样品中2个成分含量测定结果（mg／g）

流动相优化时分别考察了甲醇-甲酸水溶液、乙腈-甲酸水溶液、甲醇-磷酸水溶液等流动相系统，最终以甲醇-0.1%甲酸水溶液为流动相时色谱分离度好，故选择此流动相。

分别考察了甲醇、80%甲醇、乙酸乙酯，结果表明，以甲醇为溶剂提取效果较好，故以甲醇为溶剂。

分别比较了超声处理15，30，60 min 3个提取时间。结果表明，15 min提取的含量低于提取30 min和60 min，且后两者含量基本相同，故确定提取时间为30 min。

综上所述，该方法准确、可靠，可用于利肺片中南北五味子投料的筛查和2种成分的含量测定。