淫羊藿配方颗粒制备工艺优化及一致性评价

郭 冬 ，薛佩芸 ，穆庆丽 ，乔 园 ，陈 萍 ， ，曹雅静

（1.陕西省中医药研究院，陕西 西安 710003； 2.陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046；3.陕西省中医医院，陕西 西安 717300）

淫羊藿 Epimedium brevicornum Maxim.为小檗科多年生直立草本植物淫羊藿、箭叶淫羊藿、柔毛淫羊藿、巫山淫羊藿或朝鲜淫羊藿的地上部分[1-3]，具有补肾阳、强筋骨、祛风湿的功效，主治阳痿早泄、腰酸腿痛、四肢麻木、半身不遂、神经衰弱、健忘、耳鸣、目眩等症[4-5]。现代药理学研究表明，淫羊藿对阳痿、遗精、骨质疏松、手足麻木拘挛、更年期高血压、心脑血管疾病及提高机体免疫力、抗肿瘤、抗衰老等疗效显著。目前，已分离出多种成分，主要为异戊烯基黄酮类，一般认为8-异戊烯基黄酮及其苷类为主要活性成分，其中淫羊藿苷为特征成分，具有促进神经突触生长、抵抗神经元损伤、改善骨代谢、抗炎、抗氧化应激、抗抑郁和抗肿瘤等活性[6-8]。本研究中探讨了淫羊藿配方颗粒制备工艺的优化及一致性评价，旨在为生产提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260型高效液相色谱仪（包括自动进样器，四元泵，柱温箱，vwd检测器，美国Agilent公司）；KQ-500DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，功率为 1 500 W，频率为 40 kHz）；BT25S型电子天平，BS210S型电子天平（精度为十万分之一，赛多利斯科学仪器＜北京＞有限公司)；CP2102型电子天平（精度为万分之一，奥豪斯仪器＜常州＞有限公司）；ZLG型中药浸膏专用离心喷雾干燥机（浙江钱江伟岸干燥设备有限公司，功率为63 kW）；GZL100-25L型干法制粒机（石家庄科源机械设备有限公司，功率为7.5 kW）；乙腈（色谱纯，美国Tedia公司）；水为纯净水；甲醇、乙醇等试剂均为分析纯(天津市富宇精细化工有限公司)。

1.2 试药

淫羊藿苷对照品（批号为110737-201516，供含量测定用，中国食品药品检定研究院）；淫羊藿饮片(陕西兴盛德中药饮片有限公司，批号分别为20180301，20180310，20180510），经陕西省中医药研究院中药研究所炮制鉴定室主任杨智峰研究员鉴定为正品；淫羊藿配方颗粒（陕西必康制药集团控股有限公司，批号分别为20180915，20180916，20180917）。

2 方法与结果

2.1 提取工艺优化[9-12]

2.1.1 单因素考察

浸泡时间考察：精密称取淫羊藿饮片（批号为20180301）50 g，共 3 份，依次加水 800 mL，搅匀，浸泡，分别于 20，40，60，80，100 min 时滤出药液，读取体积，直至体积不再减少则停止观察。结果显示，浸泡60 min后，药液体积基本不再增加，计算吸水倍数为0.2，故加水量不得低于10倍量。详见表1。

表1 淫羊藿浸泡时间单因素考察结果（mL）

煎煮时间：取淫羊藿饮片21份，每份50 g，依次加水 650 mL，精密称定，依次加热回流 15，30，45，60，75，90，120 min，每个时间点平行试验3次，煎煮液滤过，冰箱静置24 h后，离心，量取上清液100 mL，置已恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，105℃烘至恒重，即可。结果提取90 min后，干膏基本无明显变化。

2.1.2 正交试验

煎煮工艺条件优选：影响水煎煮的主要因素通常有浸泡时间、煎煮时间、加水量、煎煮次数及粒度，考虑大生产通常以饮片投料，因此重点考察浸泡时间（因素A）、加水量（因素 B）、煎煮时间（因素 C）、煎煮次数（因素D）4个因素，详见表2。

表2 正交试验因素水平

正交设计及结果：以 L9（34）表安排试验，以淫羊藿总黄酮、淫羊藿苷为考察指标，结合干浸膏得率进行方差分析，以 P值判断影响因素的差异性，得煎煮最佳工艺。

2.1.3 干膏率测定

精密量取各煎煮液100 mL，分别置已恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，残渣于105℃干燥3 h，取出，置干燥器中放置 30 min，称定质量，计算出膏率（% ）。 Y（% ）＝（m1／100×V）／m2×100%（m1为干浸膏质量，V为样品溶液体积，m2为饮片质量）。

表3 正交试验设计和数据分析

2.1.4 方差分析

依据表3正交试验安排和试验数据，以干膏率（%）占 50%、淫羊藿总黄酮（UV法，%）及淫羊藿苷量（HPLC法，mg）各占25%为基数，计算综合值，以综合值进行方差分析，结果见表4。可见，各因素作用主次为因素 D＞因素 C＞因素 A＞因素 B；方差分析结果显示，D因素有显著性差异（P＜0.05），C因素次之，因素A和因素B无显著性差异（P＞0.05）。综合考虑，确定最佳工艺为 A2B2C2D3，即浸泡0.5 h，加12倍量水，煎煮3 次，每次煎煮 1.5 h。

表4 方差分析结果

2.1.5 验证试验

精密称取淫羊藿饮片50 g，精密称定，共3份，按最佳工艺进行验证试验。结果淫羊藿总黄酮、淫羊藿苷及干膏率均大于或接近于正交试验表中的最高值，且重复性好，工艺相对稳定、合理。详见表5。

表5 验证试验结果

2.2 淫羊藿苷含量测定

2.2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Diamonsil C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈 - 水（28 ∶72，V／V）；流速：1.0 mL ／min；检测波长：270 mn；柱温：30℃。理论板数按淫羊藿苷峰计应不低于1 500。

2.2.2 溶液制备

取对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含无水淫羊藿苷270.8 μg的溶液，作为对照品溶液。精密量取表3中1～9号水煎液各5 mL，置25 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，0.45 μm滤膜滤过，作为供试品溶液。精密吸取5 mL蒸馏水，置25 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，0.45 μm滤膜滤过，作为阴性对照品溶液。

2.2.3 方法学考察

专属性试验：分别精密吸取2.2.2项下3种溶液各10 μL，按拟订色谱条件测定。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置处有吸收，阴性对照无干扰。色谱图见图1。

线性关系考察：分别精密量取淫羊藿苷对照品液0.1，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mL，置 5 mL 容量瓶中，加甲醇制成每1 mL含淫羊藿苷质量浓度为5.416，27.08，54.16，81.24，108.32，135.40，162.48 μg ／mL 的溶液，按拟订色谱条件进样测定，重复2次。以淫羊藿苷峰面积平均值（Y）为纵坐标、质量浓度（X，μg／mL）为横坐标绘制标准曲线，得淫羊藿苷线性回归方程 Y＝21.602 75 X-1.193 23， R2＝ 0.999 95(n ＝ 7)。结果表明，淫羊藿苷质量浓度在 2.708 ～162.48 μg／mL 范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：取2.2.2项下对照品溶液与供试品溶液各 10 μL，分别重复进样 6次。结果的 RSD分别为0.55% 和 0.60%（n ＝6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取饮片（批号为20180301）适量，精密称定，依法制备供试品溶液，精密吸取10 μL，分别于0，1，2，4，8，12，20 h 时测定峰面积。结果的 RSD 为3.24%（n＝7），表明供试品溶液在20 h内稳定性良好。

重复性试验：取饮片（批号为20180301）6份，每份50g，精密称定，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定。结果的 RSD为5.01%（n＝6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：分别精密量取重复性试验项下6份样品溶液各1 mL，置5 mL容量瓶中，加入适量淫羊藿苷对照品溶液，以甲醇定容至刻度，按拟订色谱条件进样测定，计算回收率。结果见表6。

图1 高效液相色谱图

2.3 淫羊藿总黄酮含量测定

溶液制备：取淫羊藿苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含10.832 μg的溶液，即得对照品溶液。精密量取表3中1～9号水煎液1 mL，置100 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，即得供试品溶液。

测定法：分别取供试品溶液和对照品溶液，以相应试剂为空白，按2015年版《中国药典》通则0401紫外-可见分光光度法，于270 nm波长处测定吸光度，并计算。结果见表3。

表6 淫羊藿苷加样回收试验结果（n＝6）

2.3 配方颗粒制备及中试数据[13]

取 3批饮片（批号分别为 20180301，20180310，20180510）各 80.0 kg，以上述最佳工艺进行提取（浸泡0.5 h，加 12 倍量水，煎煮 3 次，每次 1.5 h，）滤过，合并3次滤液，于60℃减压浓缩至相对密度约为1.24 g／mL，取适量糊精，以75%乙醇为黏合剂，采用湿法制粒，干燥得颗粒 30.3 kg，共 3批(批号分别为 20180915，20180916，20180917)。试验结果见表 7。

表7 3批样品中试数据结果

2.4 淫羊藿苷量值传递

精密称取饮片 0.5 g，按 2015年版《中国药典(一部)》淫羊藿饮片含量测定项下供试品溶液制备方法制备饮片供试品溶液。精密量取3批中试提取液各20 mL，按 2.2.2项下方法制备供试品溶液。精密称取 3批中试流浸膏各0.2 g，加入10 mL热水，超声处理30 min，依法制备流浸膏供试品溶液。精密称取3批中试配方颗粒各0.2 g，加热水10 mL，超声处理30 min，依法制备配方颗粒供试品溶液。分别取以上供试品溶液，按2.2项下方法测定淫羊藿苷含量。结果见表8。可见，由饮片到配方颗粒成品，淫羊藿苷总转移率达40%，由饮片→提取液淫羊藿苷转移率降低约30%，在煎煮过程中，损失一定量的淫羊藿苷，但在制备工艺全过程中，淫羊藿苷含量较稳定。可见，淫羊藿饮片-提取液-流浸膏-配方颗粒间特征性成分的量值传递一致性较好。

表8 淫羊藿苷 中间体 配方颗粒指标成分量值传递结果（%）

3 讨论

参考2015年版《中国药典(一部)》淫羊藿的评价指标，并分析饮片-提取液-流浸膏-配方颗粒间的量值传递，确定以淫羊藿苷作为配方颗粒质控指标。本试验中对比淀粉、糊精2种辅料的流动性及成型性，结果表明，糊精比淀粉流动性、成型性好，不易吸湿，故选择糊精作为辅料。通过多次配伍考察干粉与糊精的比例，最终确定干粉-糊精（1∶1）制粒，效果更佳。将传统的中药汤剂制备成中药配方颗粒后，由于剂型发生改变，可能影响有效成分的量值传递。本研究中考察了饮片-提取液-流浸膏-配方颗粒配方成型等工艺淫羊藿苷的含量传递变化，求证各工艺过程中特征成分的含量及转移率，评价配方颗粒制备工艺的均一性，为配方颗粒替代传统汤剂的研究提供了思路。