太子参参须提取物对免疫抑制小鼠免疫保护作用的研究

衣伟萌，陈赛红，闵思明，陈俊宇，甘思言，黄一帆，张炎达，马玉芳*

1中西兽医结合与动物保健福建省高等学校重点实验室；2福建农林大学 福建省兽医中药与动物保健重点实验室，福州 350002；3福建贝迪药业有限公司，宁德 355399

太子参又名孩儿参、童参、四叶参或米参，来源于石竹科太子参属多年草本根性植物异叶假繁缕的干燥块根，是临床常用的补益中药[1]。太子参味甘、微苦而性平，偏微寒，既能益气，又可养阴生津，且药力平和，是一味清补之药，适用于脾肺亏虚、气阴不足、气津不足诸症[2]。目前已被分离出多糖、皂苷、环肽等多种生物活性成分[3]。研究表明，太子参提取物能增强机体免疫力，拮抗环磷酰胺(CY)造成的免疫抑制[4]。太子参须化学成分与太子参成分相似，研究表明太子参参须中多糖含量和皂苷含量达18.79%和0.22%[5]。Wu等[6]研究表明太子参参须能够增加血液中白细胞数，提高猪瘟抗体水平并延长作用时间，从而增强仔猪免疫能力。目前关于太子参参须提取物对免疫抑制小鼠免疫功能的研究鲜见报道。本试验先给小鼠灌胃太子参参须提取物(RPFRE)2周后，再腹腔注射CY，通过检测小鼠的免疫器官指数、脾淋巴细胞增殖、巨噬细胞吞噬功能、血清细胞因子含量等指标以及血清免疫球蛋白、补体含量的变化，探讨RPFRE对免疫抑制小鼠的免疫保护作用，为RPFRE的临床推广应用提供参考依据和数据借鉴。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 太子参参须提取物

太子参参须提取物由福建贝迪药业有限公司提供，该产品主要成为多糖和皂苷。阳性对照药物黄芪多糖(APS)，由北京爱迪森生物科技有限公司生产。

1.1.2 试验动物

清洁级KM小鼠，雄性，3～4周龄，20±2 g，购于福建医科大学实验动物中心。

1.1.3 主要试剂

RPMI 1640培养基(美国HyClone公司)；胎牛血清(CellMax公司)；Hank’s平衡盐溶液(HBSS)，磷酸盐缓冲液(PBS)(上海源培生物科技有限公司)；刀豆蛋白(ConA)，脂多糖(LPS)(美国Sigma公司)；碳酸钠(国药集团)；四甲基偶氮唑盐(MTT)(美国Merck公司)；二甲基亚砜(DMSO)(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)；印度墨汁(上海源叶生物科技有限公司)；免疫球蛋白试剂盒、补体试剂盒(浙江伊利康生物技术有限公司)；注射用CY(上海Baxter 公司)；氯化钠注射液(四川科伦药业股份有限公司)。

1.1.4 主要仪器

独立送回风净化笼具(IVC)(苏州市苏杭科技器材有限公司)；X-22R台式高速冷冻离心机(美国Beckman公司)；Milli-Q Direct8/16超纯水系统(美国Merck Millipore公司)；SE202F型电子天平(奥豪斯仪器(上海)有限公司)；AL104微量电子天平(上海梅特勒—托利多仪器有限公司)；V-1200可见分光光度计(上海美谱达仪器有限公司)；RT - 9900半自动生化分析仪(雷杜生命科学股份有限公司)；HH-4数显恒温水浴锅(国华电器有限公司)；SW-CJ-2G双人单面净化工作台(苏州净化设备有限公司)；倒置显微镜(日本Nikon公司)；CO2培养箱(美国Thermo公司)；Infinite M200 Pro多功能酶标仪(瑞士Tecan公司)；酶联免疫检测仪(BIO-RAD，美国伯乐公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 实验动物分组及处理

120只KM小鼠，随机分为对照(CK)组、模型(CY)组、黄芪多糖(APS)组、RPFRE高、中、低剂量组，共6组，每组20只。第1～14天，CK和CY小鼠灌胃双蒸水，RPFRE高、中、低剂量组(H-RPFRE组、M-RPFRE组、L-RPFRE组)小鼠分别灌胃太子参参须提取物400、200、100 mg/kg，APS组小鼠灌胃200 mg/kg APS；第15天起，CK组小鼠腹腔注射生理盐水，其余五组小鼠腹腔注射80 mg/kg BW环磷酰胺，连续给药3天。第18天，每组小鼠5只用于碳粒廓清法测定小鼠吞噬功能；5只用于MTT法测定脾T和B淋巴细胞增殖；剩余小鼠正常采样。

1.2.2 体重

试验开始后，每两天称重1次，观察试验过程中小鼠的体重变化和生长状态。

1.2.3 血样采集与处理

小鼠摘眼球采血，3 000 rpm，离心10 min，收集血清，分装于Eppendorf 管，-20 ℃保存。

1.2.4 免疫器官指数的测定

试验第18天，小鼠称重，颈椎脱臼法处死，取脾脏、胸腺、肝脏，称量，计算上述器官指数，脏器指数=脏器重量(mg)/体重(g)。

1.2.5 巨噬细胞吞噬功能的测定

巨噬细胞吞噬指数的测定参见文献[7]。小鼠尾静脉注射印度墨汁(0.1 mL/10g)，分别于注射后第2 min(T2)和10 min(T10)眼底静脉丛取血20 μL，加入2 mL 0.1% Na2CO3溶液中，充分吹打混匀，测定600 nm波长处吸光度(OD值)，以OD2、OD10分别表示T2和T10时的吸光值。计算廓清指数K吞噬指数α，公式如下：

1.2.6 小鼠脾T和B淋巴细胞增殖

1.2.6.1 制备脾淋巴细胞悬液

脾淋巴细胞的制备参见文献[8]。试验组各取5只小鼠，颈椎脱臼法处死，无菌取脾，置于灭菌的研钵中，磨碎脾脏，加入Hank’s液3.75 mL，混匀，过滤，制成单个脾细胞悬液，以Hank’s液洗涤3次，1 500 rpm离心5 min。加入含有10%胎牛血清的RPMI-1640(完全培养液)2 mL，涡旋混匀，计数，调整至7.5×106个/mL的细胞稀释液，供脾细胞增殖用。

1.2.6.2 脾淋巴细胞增殖的测定

取96孔细胞培养板，每孔加入100 μL上述脾细胞悬液，空白孔加100 μL RPMI-1640完全培养液，试验孔分别加100 μL ConA(终浓度为5 μg/mL)和100 μL LPS(终浓度为10 μg/mL)，每只小鼠设4复孔。置于5% CO2培养箱中培养44 h后，每孔加入50 μLMTT溶液，继续培养4 h，1 000 rpm，离心5 min，弃上清，每孔加入150 μL DMSO，低速震荡5min，在波长为570 nm的酶标仪处读数，以空白对照孔调零。计算方法参照参考文献[9]。计算刺激指数SI，公式如下：

刺激指数(SI)=试验孔OD值/空白孔OD值

1.2.7 血清细胞因子含量的测定

将1.2.3收集到的血清，以ELISA法按照血清细胞因子IL-2、血清细胞因子IL-4、血清细胞因子IL-6 以及血清细胞因子IFN-γ 试剂盒说明，用酶联免疫检测仪(BIO-RAD，美国伯乐公司)检测，记录每个样品在相应波长下的吸光度值，根据标准曲线计算各细胞因子含量。

1.2.8 血清中免疫球蛋白、补体含量的测定

将1.2.3分装的血清，以免疫比浊法按照血清免疫球蛋白(IgG、IgM、IgA)、补体(C3和C4)的试剂盒的说明检测，按说明对样品进行处理，后借RT-9900半自动生化分析仪检测各样品抗原-抗体复合物的浊度，通过与同样处理的校准液比较，计算各样品的免疫球蛋白和补体含量，具体处理步骤见试剂盒说明书。

1.2.9 数据统计

2 结果与分析

2.1 试验小鼠体重变化

试验小鼠体重变化见表1。由表1可知：与CK组相比，CY组小鼠末重显著低于CK组小鼠(P<0.01)，增重较CK组差异极显著(P<0.01)。与CY组相比，RPFRE各剂量组小鼠末重均高于CY组，但差异不显著(P>0.05)，其中RPFRE高剂量组和APS组小鼠增重明显(P<0.05)。

2.2 RPFRE对免疫抑制小鼠器官指数的影响

RPFRE对免疫抑制小鼠器官指数的影响如表2所示。与CK相比，CY小鼠的胸腺指数、脾脏指数以及肝指数都明显降低，且差异极显著(P<0.01)；与CY小鼠相比，RPFRE高剂量组小鼠的脾脏指数、肝指数极显著升高(P<0.01)；RPFRE低、中剂量组小鼠的脾脏指数、胸腺指数、肝指数也有升高，但无统计学意义(P>0.05)。

表1 RPFRE对免疫抑制小鼠体重的影响(mg/g)Table 1 Effect of RPFRE on weight of immunosuppressed mice (mg/g)

注：a与CK组相比，差异显著(P<0.05);A与CK组相比，差异极显著(P<0.01)；b与CY组相比，差异显著(P<0.05);B与CY组相比，差异极显著(P<0.01)；下同。

Note:aCompared with the blank group,the difference is significant (P< 0.05);ACompared with the blank group,the difference is extremely significant (P< 0.01);bCompared with the model group,the difference was significant (P< 0.05);BCompared with the model group,the difference was extremely significant (P< 0.01);The same below.

表2 RPFRE对免疫抑制小鼠脾指数、胸腺指数及肝指数的影响 Table 2 Effect of RPFRE on thymus index、spleen index and liver index of immunosuppressed mice

2.3 RPFRE对免疫抑制小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响

RPFRE对免疫抑制小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响见表3。数据显示：与CK组相比，CY组小鼠的碳粒廓清指数K及吞噬指数α均降低，且碳粒廓清指数K降低极显著(P<0.01)而吞噬指数降低显著(P<0.05)；与CY相比，RPFRE低、高剂量组的碳粒廓清指数K均升高(P<0.05)，RPFRE高剂量组的吞噬指数α升高(P<0.05)。

表3 RPFRE对免疫抑制小鼠吞噬功能的影响 Table 3 Effect of RPFRE on the phagocytic function of immunosuppressed mice

2.4 RPFRE对免疫抑制小鼠脾T和B淋巴细胞增殖的影响

RPFRE对免疫抑制小鼠脾T和B淋巴细胞增殖的影响见表4。由表4可知，与CK比较，CY组小鼠脾T和B淋巴细胞的刺激指数SI均显著降低(P<0.01)。与CY比较，RPFRE各剂量组T淋巴细胞增殖指数均显著升高(P<0.01)，而B细胞的SI仅有RPFRE高剂量组达到显著水平(P<0.05)。

表4 RPFRE对免疫抑制小鼠淋巴细胞增殖的影响Table 4 Effect of RPFRE on the proliferation in spleen lymphocytes in immunosuppressed mice

2.5 RPFRE对免疫抑制小鼠血清中细胞因子含量的影响

RPFRE对免疫抑制小鼠血清中细胞因子IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ含量的影响见表5。从表5可知，与CK相比，CY小鼠血清中IL-2、IL-4、IFN-γ含量降低(P<0.01)；与CY相比，RPFRE各剂量组及APS组的IL-2含量均升高(P<0.01)；RPFRE高剂量组IL-4含量极显著升高(P<0.01)、IFN-γ含量显著升高(P<0.05)。RPFRE各剂量组小鼠的IL-6含量与剂量呈正相关，但差异不显著。

表5 RPFRE对免疫抑制小鼠IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ含量的影响 Table 5 Effect of RPFRE on contents of cytokines IL-2,IL-4,IL-6 and IFN-γ in immunosuppressed mice

2.6 RPFRE对免疫抑制小鼠免疫球蛋白(IgA、IgM、IgG)和补体(C3和4)的影响

RPFRE对免疫抑制小鼠免疫球蛋白IgA、IgM、IgG的影响见表6。由表6可知，与CK相比，CY小鼠IgA、IgM、IgG含量均极显著降低(P<0.01)。与CY相比，RPFRE低剂量组IgA和IgG含量显著升高(P<0.05)，IgM含量极显著升高(P<0.01)；RPFRE中剂量组IgA含量显著升高(P<0.05)；RPFRE高剂量组IgA和IgM含量极显著升高(P<0.01)，IgG含量显著升高。高剂量组IgA、IgM以及IgG水平与APS组相当甚至略高于APS组。

表6 RPFRE对免疫抑制小鼠免疫球蛋白IgA、IgM、IgG含量的影响(mg/L) Table 6 Effect of RPFRE on contents of IgA、IgM、IgG in immunosuppressed mice (mg/L)

RPFRE对免疫抑制小鼠补体C3和C4的影响见表7。由表可知，与CK相比，CY小鼠补体C3和C4含量均极显著降低(P<0.01)；与CY相比，RPFRE低、中剂量组C4含量显著升高(P<0.05)，C3含量有所增加但差异不显著。APS及RPFRE高剂量组小鼠C3和C4含量升高极显著(P<0.01)。

表7 RPFRE对免疫抑制小鼠补体C3和C4含量的影响(mg/L)Table 7 Effect of RPFRE on contents of C3 and C4 in immunosuppressed mice(mg/L)

3 讨论

环磷酰胺是一种强免疫抑制药，通过DNA烷基化破坏DNA的合成，进而抑制DNA的复制和蛋白质的合成，从而导致免疫功能低下，因此常作为复制动物免疫低下模型的造模药物[10]。研究表明，CY造模成功的小鼠常表现为精神萎靡、被毛松散、体重下降，有的出现眼结膜充血、掉毛等现象[11]。本试验中，腹腔注射CY后，CY组及各试验组小鼠均表现不同程度的被毛松散、精神不振，与CK组相比，CY小鼠增重极显著降低。与CY相比，各试验组增重有不同程度的升高这从侧面反映出预先给予RPFRE，能拮抗CY所致的体重降低，对CY模型小鼠有一定的免疫保护作用。

脾脏、胸腺是重要的免疫器官，其器官指数能直观地反映有机体的免疫功能。CY是作用显著的免疫抑制剂，能使胸腺、脾脏萎缩，造成胸腺、脾脏指数下降[10]。研究表明，香菇多糖、茯苓多糖、银耳多糖以及虫草多糖均能不同程度的升高CY所致的免疫抑制小鼠的胸腺系数，且各多糖按一定比例混合而成的复合多糖效果最好[12]。款冬皂苷和多糖均能不同程度的提高小鼠胸腺和脾脏系数[13]。天门冬多糖能够提高免疫抑制小鼠的脾脏指数和胸腺指数[20]。本试验中太子参参须提取物含有太子参多糖、太子参皂苷等多种太子参药用成分，经检测该产品中糖含量为54.26%，皂苷含量为0.82%。课题组前期研究表明太子参多糖可以改善CY造成的免疫损伤，提高免疫抑制小鼠的免疫器官指数，促进其淋巴细胞增殖和细胞因子(IL-2和IFN-γ)分泌[14]。本试验结果显示，RPFRE能拮抗CY免疫抑制作用，缓解CY所致的免疫器官萎缩，从而提高机体的免疫力。这与大多数试验研究得出的结论“多糖能缓解机体的免疫抑制，提高机体免疫器官指数，增强免疫力”一致[15,16]。

临床中常采用碳粒廓清法来测定吞噬细胞的吞噬指数[17]。Sun等[18]研究表明刺五加酸性多糖能缓解CY所致的小鼠外周血白细胞数目减少、巨噬细胞吞噬功能减弱，增强免疫抑制小鼠的巨噬细胞吞噬能力，提高TNF-α和IFN-γ水平。桔梗皂苷D能够促进淋巴细胞增殖，增强巨噬细胞的吞噬能力，并可刺激淋巴细胞IL-2、IL-4和巨噬细胞TNF-α、IL-12的分泌，从而增强小鼠淋巴细胞和巨噬细胞的免疫调节活性[19]。本试验中，CY小鼠K值和α值均显著降低，这与上述研究结果一致，说明确已造成小鼠免疫抑制。RPFRE高剂量组能增强K值和α值，拮抗CY损伤，并且与阳性对照组APS作用效果相当，这同Zhang等[20]“黄芪多糖可提高正常小鼠及免疫抑制小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬百分率及吞噬指数”这一结论一致。说明该太子参参须提取物具有其他药用植物的多糖、皂苷提取物同样的功能，能缓解CY小鼠巨噬细胞吞噬能力减弱，增强CY小鼠的免疫能力。

淋巴细胞增殖是对抗原或有丝分裂原诱导的刺激的反应，其广泛用于评估细胞免疫应答[21]。一般而言，ConA刺激T淋巴细胞免疫，而LPS刺激B淋巴细胞免疫。研究表明，党参总皂苷纳米乳能提高免疫抑制小鼠血清IL-2和IFN-γ水平、升高脾T细胞增殖刺激指数，从而提高免疫抑制小鼠的细胞免疫水平[22]。天门冬多糖能在Con A 或者LPS刺激下提高T、B淋巴细胞增殖率[23]。本试验中，RPFRE借助Con A 和LPS刺激，激发脾细胞更快增殖，结果显示RPFRE能显著刺激T细胞增殖(P<0.01)，提高B细胞SI值。说明RPFRE能干预CY对细胞增殖的抑制，拮抗CY损伤，从而增强小鼠的免疫抵抗能力。

IL-2、IFN-γ是由TH1细胞分泌的细胞因子，主要参与细胞免疫；IL-4、IL-6由TH2细胞分泌，参与机体体液免疫。Tong等[23]研究表明，天门冬多糖能增加CY诱导的小鼠的IL-2、IL-4含量，从而提高小鼠的免疫防御功能。六苓扶正方剂量依赖性地提高模型小鼠IL-2和IgG水平[11]。丹参-苦参提取物高剂量可以显著促进IL-6和CXCL1的分泌[24]。研究表明，太子参多糖能够拮抗环磷酰胺对小鼠回肠中IL-6分泌的抑制作用[25]，且太子参多糖和硒化修饰以后均可以增加免疫小鼠TNF-α和IL-6的分泌[26]。本试验中，RPFRE能抵抗CY对机体造成的免疫抑制，增加IL-2、IL-4、IFN-γ含量(P<0.05)，促进IL-6分泌(P>0.05)。结果表明RPFRE具有天然药用植物的功能，能通过遏制细胞因子含量降低，拮抗CY所致的免疫损伤，从而增强机体防御能力。

研究表明天然中药对免疫球蛋白IgM、IgG、IgA有正向调节作用[27]。Lin等[28]研究表明，党参多糖和硒化党参多糖均能够增加免疫抑制小鼠血清中IgG和IgM的含量，且硒化修饰过后的党参多糖效果显著。Zhang等[29]研究表明茯苓多糖可以促进小鼠血清中IgG和IgM的生物合成，提高小鼠免疫功能。Song等[26]研究表明，硒化太子参多糖够减缓CY所致的免疫损伤小鼠IgG和IgM的降低，从而提高免疫能力。RPFRE系天然中药太子参的参须提取物，试验中，高剂量RPFRE能拮抗CY对免疫球蛋白和补体分泌的抑制作用，增加IgM和IgG含量(P<0.01)，促进C3和C4分泌(P<0.01)。说明RPFRE保有天然中药太子参的有效药用成分，能通过调节免疫球蛋白和补体含量起到免疫保护作用。

上述结果表明，先灌胃小鼠RPFRE能通过拮抗CY所致的免疫抑制小鼠脏器指数降低，巨噬细胞吞噬功能减弱，脾T淋巴细胞增殖能力减弱，血清免疫球蛋白、补体及细胞因子含量降低等，发挥对免疫抑制小鼠免疫保护作用，该作用可能是由于RPFRE是天然药用植物太子参的参须所提，其含有太子参参须多糖和皂苷，保有太子参的药用价值。但有关太子参参须多糖和皂苷单独对免疫抑制小鼠免疫调节作用仍有待进一步深入研究。