天麻-附子祛风通络药对抗类风湿性关节炎风寒湿痹症大鼠的干预机制

郭步伐，杨 杰*，彭启伦，范光忠，姚维一，邓佳丽，龚弟鸿，丁维俊

1毕节医学高等专科学校基础医学系，毕节 551700；2成都中医药大学基础医学院，成都 610075

天麻为兰科植物天麻属的干燥块茎，主产于四川、云南、贵州等地。天麻味甘、药性平和，附子辛、甘、大热、有小毒。由于两种中药均味甘，因此两药配伍组成祛风通络药对，能相互调和其药性，广泛用于类风湿性关节炎的治疗[1]。首先，Peng等[2]筛选与天麻配伍具有祛风通络功效的400首方剂，从中发现天麻与川芎、当归、牛膝和附子等配伍频次之高，在治疗顽固性痹症中发挥着重要作用。Lai等[3]采用“中医传承辅助系统”筛选出与天麻进行配伍的106首方剂，认为天麻与附子配伍是祛风通络治疗痹病的最佳药物组合。其次，天麻与附子配伍组成祛风通络药对在《太平圣惠方》、《圣济总录》和《奇效良方》天麻丸中均有记载，其中明代方贤着所著《奇效良方》天麻丸中天麻与附子配伍的剂量比为1∶1和3∶2。当今，Chen等[4]根据古方天麻丸研制的天麻浸膏丸用于治疗类风湿性关节炎，其总有效率为82.8%。因此，我们在古方天麻丸所含天麻-附子剂量配比的基础上设计天麻-附子药对1∶1、3∶2和2∶3剂量比组，观察天麻-附子药对三种剂量配比抗RA的疗效；在此疗效的基础上，从环加氧酶COX-2/COX-1角度阐释天麻-附子祛风通络药对抗胶原诱导的RA风寒湿痹症大鼠模型[5]的干预机制。

1 材料与仪器

1.1 实验材料

1.1.1 药品

红天麻GastrodiaelataBl购自贵州毕节大方天麻公司，附子Radix Aconiti Lateralis Preparata购自四川江油鑫临附子药业有限公司。产地分别为贵州毕节大方和四川江油。由成都中医药大学邓赟教授鉴定。

天麻-附子祛风通络药对(1∶1、3∶2、2∶3)冻干粉制备：按比例称取天麻、附子粗粉，分别加10倍体积水浸泡30 min，先煎附子1 h，再加天麻煎1 h，过滤；第二次在残渣中加8倍体积水煎煮1 h，过滤，合并两次滤液，浓缩至相对密度1∶1.1的膏状物，再制成天麻-附子药对不同剂量配比的冻干粉，4 ℃保存备用。

1.1.2 试剂

牛Ⅱ型胶原(美国Chondrex公司，批号：20022),完全弗氏佐剂(美国Chondrex公司，批号：7023)；大鼠类风湿因子RF(批号：ERC156)，C反应蛋白CRP(批号：ERC07)，血栓素B2TXB2(批号：ERC88)，前列腺素E2PGE2(批号：ERC16)，前列环素PGI2(批号：ERC129)酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒均购自依科赛生物科技有限公司。BeyoFastTMSYBR Green qPCR Mix(2X)(碧云天生物技术公司，批号：D7260)。PrimeScriptTMRT Reagent Kit(TaKaRa公司，批号：RR037A)。

1.1.3 动物

SPF级SD雄性大鼠60只，6周龄，购自成都达硕动物有限公司，许可证号SCXK(川)2015-030。饲养于成都中医药大学基础医学实验中心清洁级动物房，自由饮水和进食。

1.2 仪器

FYL-YS-138L恒温冷藏柜(北京福意联医疗设备有限公司)，Multiskan MK3全自动酶标仪(美国Thermo Scientific公司)，CFX96荧光定量PCR仪(美国Bio-Rad公司)，NanoDrop2000超微量分光光度计(美国Thermo公司)。

2 方法

2.1 类风湿性关节炎风寒湿痹症大鼠模型的建立

选用SPF级SD雄性大鼠60只，6周龄，大鼠适应性喂养1周后，任意选取8只大鼠作为正常组，其余大鼠参考文献按照胶原诱导的关节炎法(CIA法)[5]造模。取2 g/L牛Ⅱ型胶原置于4 ℃冰箱中过夜，与含有5 g/L卡介苗的完全弗氏佐剂(CFA)等体积混合，充分研磨至乳白色黏稠液体，使之乳化，胶原最终质量浓度为1 g/L。于大鼠的尾根部至后背部进行皮下注射胶原乳化剂0.2 mL。14天后按初次致炎的方法和剂量重复致炎。风寒湿刺激条件:自致炎第1天起，将致炎大鼠置于恒温冷藏柜中，风速18 m/s，相对湿度95%～100%，每次30 min，每天1次，连续18天。定期观察大鼠的一般情况、关节肿胀程度、颜色、关节活动情况等变化。

2.2 动物分组及给药

致炎21天，根据关节炎指数≥4筛选模型建立成功的大鼠，按各组大鼠关节炎指数无统计学差异，均匀地分为模型组、天麻-附子祛风通络药对1∶1(含药对生药2.7 g/kg)、2∶3(含药对生药3.4 g/kg)、3∶2(含药对生药3.4 g/kg)剂量比组，每组8只，灌胃给药每日一次，连续21天。正常组和模型组按10 mL/kg灌胃生理盐水。各给药组剂量均按体表面积换算的成人临床等效剂量[5]的1.5倍进行计算，同时以明代《奇效良方》天麻丸所含天麻附子配伍的比例为依据。

2.3 检测指标

2.3.1 大鼠体重

致炎前起，每周称量并记录大鼠体重。

2.3.2 关节炎指数

致炎第21天起，每周按大鼠多发性关节炎全身5级评分法[5,6]对病变程度进行评分。0分，正常；1分，足趾关节红肿；2分，多个趾关节或趾跖关节肿胀；3分，踝关节以下的足爪肿胀；4分，全部足爪肿胀。累计四肢关节炎积分为每只大鼠的关节炎指数，最高为16分。

2.3.3 血清细胞因子

致炎42天后，10%水合氯醛(0.35 mL/100 g)腹腔注射麻醉各组大鼠，心脏取血2～3 mL，3 000 rpm离心20 min，分离血清，-80 ℃保存备用。ELISA法测定血清类风湿因子(RF)、C反应蛋白(CRP)、血栓素B2(TXB2)、前列腺素E2(PGE2)和前列环素(PGI2)的水平。

2.3.4 RT-qPCR检测各组大鼠全血COX-1和COX-2 mRNA的表达量

致炎42天后，10%水合氯醛(0.35 mL/100 g)腹腔注射麻醉各组大鼠，心脏取血1～2 mL，置于含有乙二胺四乙酸(EDTA)的离心管中，加3倍体积红细胞裂解液，轻轻颠倒混匀，3 000 rpm离心10 min，弃上清，用2 mL 磷酸缓冲液(PBS)洗涤细胞2次，放入1 mL RNA Later之中，-80 ℃保存。

根据Multisource Total RNA Miniprep Kit(AXYGEN，AxyPrepTM，07418KD1)试剂盒操作说明书提取各组样本总RNA。按照PrimeScript TM RT Reagent Kit (Takara)说明书进行反转录操作。采用20 μL反应体系(SYBR Green qPCR Mix 10 μL，Forward Primer 1 μL，Reverse Primer 1 μL，cDNA 2 μL，dH2O 6 μL)，扩增反应条件如下：95 ℃ 30 s 热启动和预变性，95 ℃ 5 s 变性，60 ℃ 35 s 退火，72 ℃ 30 s 充分延伸，共40个循环。引物信息见表1。β-actin为内参基因，相对表达水平采用2-△△Ct公式进行计算。

表1 引物信息Table 1 Primer information

2.4 统计学方法

3 结果

3.1 天麻-附子不同剂量配比对大鼠一般情况及体重的影响

致炎10天，类风湿性关节炎风寒湿痹症大鼠足趾皮肤发红，轻度肿胀，致炎14天再次强化免疫，大鼠足背、踝关节肿胀明显，活动量减少，食少，体重增长缓慢，甚至下降；致炎21天，大鼠足背、踝关节肿胀进一步加重，体重下降，下肢触地无力。自致炎第21天开始给药，各治疗组大鼠体重逐渐上升，见表2。致炎第42天(给药第21天)，各治疗组大鼠体重较模型组明显升高(见表2)。

表2 天麻-附子不同剂量配比对大鼠体重的影响Table 2 Effect of different dose-ratios of GRHP on rats′ weight = 8)

注：与正常组相比，*P<0.05；#P<0.01。与模型组相比，△P<0.01；△△P<0.05。TF11、TF32、TF23组分别为天麻-附子药对1∶1、3∶2、2∶3剂量比组。

Note:Compared with normal,*P<0.05;#P<0.01.Compared with model,△P<0.01;△△P<0.05.TF11,TF32 and TF23 group were GRHP 1∶1,3∶2 and 2∶3 dose-ratio groups,respectively.

3.2 天麻-附子不同剂量配比对大鼠关节炎指数的影响

致炎28天，模型组大鼠关节炎指数达到高峰。各治疗组随着治疗时间的延长，关节炎指数逐渐下降。致炎42天(给药第21天)，各治疗组与模型组相比，其关节炎指数明显下降(见表3)。

表3 天麻-附子不同剂量比对大鼠关节炎指数的影响Table 3 Effect of different dose-ratios of GRHP on rats′ AI = 8)

注：与模型组相比，*P<0.05；#P<0.01。

Note:Compared with model,*P<0.05;#P<0.01.

3.3 天麻-附子不同剂量配比对血清RF、CRP水平的影响

表4所示，模型组血清RF、CRP水平明显高于正常组，可成为类风湿性关节炎风寒湿痹症大鼠模型的判定标准之一。与模型组相比，天麻-附子1∶1、2∶3、3∶2剂量比组能明显降低类风湿性关节炎风寒湿痹症大鼠血清RF和CRP的水平(P<0.05，P<0.01)，因而各剂量比组可改善大鼠足趾及踝关节肿胀症状。

表4 天麻-附子不同剂量比对大鼠血清RF和CRP水平的影响Table 4 Effect of different dose-ratios of GRHP on RF and CRP levels in rats′ blood = 8)

注：与正常组相比，*P<0.01。与模型组相比，#P<0.05；△P<0.01。

Note:Compared with normal,*P<0.01.Compared with model,#P<0.05;△P<0.01.

3.4 天麻-附子不同剂量配比对血清TXB2、PGE2、PGI2水平的影响

表5所示，致炎42天，与正常组相比，模型组血清PGE2和PGI2水平明显升高，为类风湿性关节炎风寒湿痹症大鼠主要的致炎因子之一。与模型组相比，各剂量配比组血清PGE2和PGI2水平下降，其中天麻-附子药对1∶1剂量组和2∶3剂量组下降最为明显，P<0.01。

表5 天麻-附子不同剂量比对大鼠血清TXB2、PGE2、PGI2水平的影响Table 5 Effect of different dose-ratios of GRHP on TXB2,PGE2 andPGI2 levels in rats′ blood serum = 8)

注：与正常组相比，*P<0.01；#P<0.05。与模型组相比，△P<0.01；△△P<0.05。

Note:Compared with normal,*P<0.01;#P<0.05.Compared with model,△P<0.01;△△P<0.05.

3.5 天麻-附子不同剂量配比对COX-1和COX-2 mRNA表达的影响

致炎42天，与正常组相比，模型组COX-1 mRNA表达低于正常组，COX-2 mRNA表达高于正常组，P<0.05。与模型组相比，各剂量组能明显降低COX-2 mRNA的表达。各剂量组之间COX-1 mRNA、COX-2 mRNA表达无统计学差异(见表6)。

表6 天麻-附子不同剂量比对大鼠全血COX mRNA表达的影响Table 6 Effect of different dose-ratios of GRHP on rats′ whole blood COX mRNA = 8)

注：与正常组相比，*P<0.05。与模型组相比，#P<0.05；△P<0.01。

Note:Compared with normal,*P<0.05.Compared with model,#P<0.05;△P<0.01.

4 讨论

类风湿性关节炎是一种以关节滑膜炎为特征的慢性全身性自身免疫性疾病。滑膜炎持久反复发作，可导致关节内软骨和骨的破坏，关节功能障碍，甚至残废，严重影响患者的生活质量[7,8]。目前，CIA和AIA法是常见的复制类风湿性关节炎动物模型的方法之一，CIA法大鼠模型关节炎症状与人类类风湿性关节炎相类似[9]。经大鼠尾根部至后背部皮下注射胶原乳剂14天之后，大鼠足趾及踝关节红肿症状逐渐加重，饮食减少乃至体重增幅减少。致炎21天，以关节炎指数≥4为模型判定标准，显示52只SD大鼠成模率为61.54%。血清RF、CRP水平是类风湿性关节炎的诊断标准之一[8]，我们采用ELISA法检测类风湿性关节炎大鼠血清RF和CRP的水平。结果显示，与正常组相比，模型组大鼠血清RF、CRP血清浓度明显升高，进一步证实RA模型复制成功。

药对是临床上常用的两味药物的配伍形式。根据中药药性理论，天麻味甘、药性平和，附子辛、甘、大热、有小毒，两味药配伍组成祛风通络药对用于类风湿性关节炎的治疗。在与天麻配伍具有祛风通络功效的400首方剂中，其中天麻与附子配伍的频次较高[2]。《大平圣惠方》、《奇效良方》和《圣济总录》中记载的天麻丸所用的天麻-附子剂量配比为1∶1和3∶2。因此，本课题组在古方天麻丸所用天麻-附子剂量配比的基础上，观察天麻-附子剂量配比1∶1、3∶2和2∶3抗RA的疗效。

首先，给药21天(致炎42天)之后，天麻-附子药对各剂量比可降低RA大鼠关节炎指数及血清RF、CRP的水平，同时增加其各剂量组大鼠的体重，提示了天麻-附子祛风通络药对各剂量配比组具有较好的抗炎抗风湿作用(见表2、表3和表4)。从RA大鼠关节炎指数、血清炎症因子水平到COX mRNA表达程度，天麻附子1∶1和3∶2剂量比组对各检测指标的影响与模型组相比，统计学差异不一致；然而，天麻附子药对2∶3剂量比组对各检测指标的影响，与模型组相比，P值均小于0.01,可认为是天麻附子药对抗RA的最佳剂量比，在于此剂量比附子用量稍高于天麻，并与附子温通经络治疗痹症的中医理论有一定的关系[10,11]。

其次，COX是影响花生四烯酸代谢的限速酶，包括COX-1和COX-2两种类型，COX-1 mRNA表达于胃粘膜、肾血管等正常组织中，具有生理性保护作用，COX-2 mRNA在炎症刺激下强烈表达，并促进前列腺素等炎症因子的释放[12,13]。大多数研究均表明[14,15]，COX表达于类风湿性关节炎滑膜组织中，COX-1 mRNA表达衍生的TXA2具有促凝作用，COX-2 mRNA表达衍生的PGI2具有抗凝作用，因此，TXA2与PGI2在生理功能上呈现相互拮抗。TXA2半衰期较短，难以检测，故通过检测TXB2的浓度进行间接地评价[16]。表5所示，各组大鼠血清中PGI2的浓度明显高于TXB2的浓度，与COX mRNA表达程度相关(见表6)。由于天麻-附子药对各剂量比组均能明显降低RA大鼠COX-2 mRNA的表达，对COX-1 mRNA表达影响较小(见表6)，且各剂量组能明显降低RA大鼠血清PGE2和PGI2的含量(见表5)，因此天麻-附子药对通过下调COX-2 mRNA表达而成为其具有抗炎抗风湿作用的原因之一。

至今，从单味药到复方，从单一成分到多组分，从单一靶点到多靶点网络效应，天麻药对研究层次逐渐深入。由天麻与川芎组成的两味方含有20种活性成分，与48个偏头痛相关靶点结合，产生了潜在的协同治疗效应[17,18]。天麻钩藤饮是治疗脑缺血及相关疾病的常用方剂，其主要的药物是天麻和钩藤，其神经保护效应的分子机制在于能上调Nrf-2、Bcl-2及抗氧化反应信号转导通路基因的表达，明显缩短大脑中央动脉阻塞的范围[19]。我们首次从COX-2/COX-1角度阐释古方天麻丸中天麻-附子祛风通络药对剂量配比抗RA的作用机制，其天麻-附子药对多成分、多靶点和多途径的网络效应机制有待于进一步深入研究。