灭活型副干酪乳杆菌L9常温酸奶调节肠道菌群缓解便秘作用研究

王 然， 李桂花， 王鹏杰， 刘 力， 刘治麟， 张 炎，*

(1.中国农业大学 营养与健康系， 北京 100083； 2.中国农业大学 食品科学与营养工程学院， 北京 100083； 3.河北省畜产食品技术创新中心，河北 廊坊 065201； 4.北京和益源生物技术有限公司， 北京 100089)

便秘是一种常见的功能性胃肠疾病，可导致腹痛、厌食、痔疮和抑郁等疾病，在全球的发病率是14%[1-3]。目前，用于便秘的治疗方法主要包括药物和非药物治疗。药物的治疗效果有限，甚至会产生依赖作用，一旦停止使用，便秘往往会复发，而且会产生一些副作用，如头痛、腹痛、恶心、腹泻和心血管疾病等，会使治疗的周期延长[4]；非药物治疗主要是生活方式的改变，包括体育锻炼，调整饮食等[5]。

研究表明，益生菌可调节肠道菌群，产生大量短链脂肪酸，降低结肠的pH值和传输时间，从而促进肠道蠕动[6]。 服用益生菌已成为治疗便秘的有效方法，但是活菌型益生菌在使用中仍然存在一些问题，如在免疫缺陷患者等弱势人群使用时的不安全性[7],在胃肠道低pH值和蛋白酶丰富的环境中存活率低等[8]。灭活益生菌安全性高，没有菌量限制，可与抗生素合用，其产品易于储存和运输，具有较长的货架期。灭活益生菌在日本、美国、俄罗斯和德国等国家得到广泛研究和应用，我国对于益生菌的研究多限于活菌，在灭活菌及其制品方面的研究还比较少[9-10]。灭活益生菌功能性的研究主要集中于调节免疫[11]、缓解过敏[12]和调节肠道菌群[13]等，其是否具有缓解便秘的作用尚缺乏研究。

副干酪乳杆菌L9分离自健康人肠道，具有调节免疫[14-15],增加小鼠肠道短链脂肪酸[16]和调节人体肠道菌群等益生功能[17]，其灭活菌是否具有缓解便秘的功能尚待研究。本研究拟通过人群实验，评价灭活型常温副干酪乳杆菌L9酸奶对便秘人群症状的改善作用和调节肠道菌群的作用，为含有灭活型乳酸菌产品的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 菌种及试验样品

副干酪乳杆菌L9(简称L9)，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC No. 9800；常温酸奶和含灭活副干酪乳杆菌L9的常温酸奶(简称L9常温酸奶)样品(200 g/瓶)，由中国农业大学益生菌研究中心制备。

常温酸奶制备方法：7%白砂糖与93%生牛乳经过95 ℃，300 s杀菌后，添加嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌(1×106CFU/mL)，43 ℃发酵5 h，80 ℃灭菌1 min，得到常温酸奶实验样品。

L9常温酸奶制备方法：7%白砂糖与93%生牛乳经过95 ℃，300 s杀菌后，添加嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌(1×106CFU/mL)，并添加L9菌粉(1×108CFU/g)，43 ℃发酵5 h，80 ℃灭菌1 min，得到L9常温酸奶实验样品。

1.2 受试对象

1.2.1纳入标准

年龄18～65岁，每周排便3～4次，长期或间歇性便秘、大便不成形，排便次数不规律的受试者。

1.2.2排除标准

1)主诉不清者，体质虚弱无法进行试验者，孕期及哺乳期、经期妇女。

2)30 d内进行过外科手术引起便秘症状发生者。

3)合并有心血管、肝、肾和造血系统等严重全身疾病患者，便秘困难并伴有疼痛者，或有其他伴随疾病正在治疗者。

4)不能经口进食者或不能按规定服用受试样品者。短期内服用与受试功能有关的物品，影响到结果的判断者。

5)长期服用或实验开始前15 d内服用抗生素类药物者。

1.3 试验设计

计划招募受试者60人，随机分成常温酸奶组和L9常温酸奶组，尽可能考虑到影响结果的主要因素如年龄、性别、日常饮食、便秘原因等，每个年龄段人数尽量保持均衡，以保证组内的可比性。经过7 d排空期后，采集受试者粪便样本，再连续饮用试验样品28 d，每天饮用常温酸奶或L9常温酸奶1瓶，饮用期结束后采集受试者粪便样本。试验期间，受试者每周填写肠道健康调查表，其中包括排便情况、不良反应等。试验期间不改变原来的饮食习惯，正常饮食。

1.4 观察及检测指标

1.4.1观察指标

1)每日排便次数：受试者记录每日排便次数的变化。

2)排便状况：根据排便困难程度(腹痛或肛门烧灼感、下坠感、不适感，有否便频但排便困难而量少等症状)分为Ⅰ～Ⅳ级，统计积分值。

Ⅰ级(0分)：排便正常。

Ⅱ级(1分)：仅有下坠感、不适感。

Ⅲ级(2分)：下坠感、不适感明显，或有便频但排便困难而量少，较少出现腹痛或肛门烧灼感。

Ⅳ级(3分)：经常出现腹痛或肛门烧灼感，影响排便。

3)粪便性状：根据布里斯托(Bristol)粪便性状分类法将粪便性状分为Ⅰ～Ⅲ 级。

Ⅰ级(0分)：像香肠或蛇，平滑而且软；像香肠，但在它的表面有裂痕；软的团块，有明显的边缘(容易排出)。

Ⅱ级(1分)：香肠形状，但有团块；松散的块状，边缘粗糙，像泥浆状的粪便。

Ⅲ级(2分)：分离的硬团，像果核(不易排出)。

1.4.2检测指标

1.4.2.1 粪便短链脂肪酸含量的检测

粪便短链脂肪酸提取：称取0.1～0.2 g粪便样品于1 mL含有庚酸(浓度为1 mmol/L)的乙醚溶液中，用均质机匀浆1 min，10 000 r/min离心2 min。转移上清液有内插管的进样瓶中进行气相色谱检测。

气相色谱检测：检测器为FID氢火焰离子检测器；色谱柱为60～80目(酸洗、硅烷化)不锈钢柱(25 m×0.320 mm)，涂渍填充10%FFAD和1% H3PO4；升温程序为80 ℃保持1 min，以10 ℃/min升至140 ℃，保持5 min，以25 ℃/min升至240 ℃，保持4 min；载气(N2)压力260 kPa；氮气流速为40 mL/min，氢气流速为30 mL/min，空气流速为400 mL/min；进样量1 μL；检测温度280 ℃。N2000色谱工作站收集信号并检测。使用外标法进行定量。

1.4.2.2 粪便肠道菌群的检测

肠道菌群多样性测序利用Illumina PE300测序平台，对16S rDNA进行高通量测序，测序工作由上海美吉生物医药科技有限公司完成；基于I-Sanger云平台(https:∥www.i-sanger.com/)进行生物信息学及数据统计分析。

1.5 数据处理

利用SPSS 20.0软件对结果进行统计分析。各项指标结果以“平均值±标准差”(mean±SD)表示。组内前后比较采用配对样本t检验，两组间样本的比较采用独立样本t检验，P<0.05视为显著性差异，具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 受试者基本情况

招募受试者65人，有61人完成试验，受试者年龄、性别、体重等基本情况如表1，两组间无显著差异(P>0.05)，可比性较好。

表1 受试者饮用产品前一般情况

2.2 受试者排便情况

常温酸奶和L9常温酸奶对受试者排便情况的影响如表2。表2显示，饮用前，常温酸奶组与L9常温酸奶组的排便次数、排便状况积分和粪便性状积分没有显著差异，具有可比性。饮用28 d后，常温酸奶组的排便次数显著高于饮用前(P<0.05)，排便状况积分和粪便性状积分与饮用前相比没有显著差异；L9常温酸奶组的排便次数极显著高于饮用前(P<0.01)，粪便性状积分和排便状况积分极显著低于饮用前(P<0.01)；两组间相比，L9常温酸奶组的排便次数显著高于常温酸奶组(P<0.05)，排便状况积分和粪便性状积分极显著低于常温酸奶组(P<0.01)。研究结果表明，常温酸奶可显著增加受试者排便次数，添加灭活副干酪乳杆菌L9后，受试者排便次数、排便状况和粪便性状都有极显著改善，说明L9有利于提高排便次数，减少排便不适，形成软便，改善粪便的质量。

2.3 粪便短链脂肪酸含量变化

短链脂肪酸是肠道微生物发酵碳水化合物生成的主要次级代谢产物，包括乙酸、丙酸、丁酸[18],也是表征肠道菌群影响人体健康和生理机能的重要物质。饮用前后受试者粪便中短链脂肪酸含量的变化情况如图1。图1显示，饮用前，常温酸奶组和L9常温酸奶组的短链脂肪酸含量没有显著差异，具有可比性。饮用后与饮用前相比，常温酸奶组丙酸和总酸的含量显著增加(P<0.05)；L9常温酸奶组乙酸、丙酸、丁酸和总酸的含量极显著增加(P<0.01)。两组间相比，L9常温酸奶组丁酸含量极显著高于常温酸奶组(P<0.01)，丙酸和总酸含量显著高于常温酸奶组(P<0.05)。研究结果表明，常温酸奶和L9常温酸奶可以显著增加粪便中短链脂肪酸的含量，添加灭活副干酪乳杆菌L9可以极显著增加短链脂肪酸的含量，说明灭活副干酪乳杆菌L9有利于短链脂肪酸的生成。短链脂肪酸可刺激肠道神经系统，缩短肠道运输时间，从而缓解便秘[19]。

表2 受试者每周排便情况

*表示组内饮用后与饮用前相比具有显著差异(P<0.05)；**表示组内饮用后与饮用前相比具有极显著差异(P<0.01)；#表示饮用后两组间具有显著差异(P<0.05)；##表示饮用后两组间具有极显著差异(P<0.01)。

*表示组内饮用后与饮用前相比具有显著差异(P<0.05)；**表示组内饮用后与饮用前相比具有极显著差异(P<0.01)；#表示饮用后两组间具有显著差异(P<0.05)；##表示饮用后两组间具有极显著差异(P<0.01)。图1 饮用前后短链脂肪酸的变化Fig.1 Changes of short-chain fatty acids before and after intake of yogurt

2.4 肠道菌群的改变

2.4.1群落结构组成 PCA分析

由群落结构组成PCA分析可知(如图2)，饮用前两组便秘人群的组间差异ANOSIM分析结果为R=0.007 4，P=0.298(如图2(a))，说明两组人群肠道菌群的整体结构没有差异，组间可比性好。常温酸奶组饮用后(CWd28)与饮用前(CWd0)相比，组间差异ANOSIM分析结果为R=0.197 8，P=0.001(如图2(b))，表明饮用常温酸奶可改变肠道菌群整体结构；L9常温酸奶组饮用后(L9CWd28)与饮用前(L9CWd0)相比，组间差异ANOSIM分析结果为R=0.230 8，P=0.001(如图2(c))，表明饮用L9常温酸奶改变菌群的整体结构；常温酸奶与L9常温酸奶组相比，组间差异ANOSIM分析结果为R=0.035 3，P=0.075(如图2(d))，显示两组间没有显著差异，说明灭活L9对肠道菌群的整体结构无显著影响。以上结果表明，常温酸奶和L9常温酸奶对肠道菌群的整体结构有显著影响，但是灭活L9对肠道菌群的整体结构无显著影响。

每个点代表每个人群样本，PCA分析基于bray_curtis距离算法。图2 各组小鼠肠道菌群PCA分析Fig.2 PCA of gut microbiota in each group

2.4.2物种组间差异显著性检验分析

利用Student’st检验方法对物种进行两组间差异显著性分析，结果如图3。图3显示，在丰度百分比大于1.0%的物种中，组内比较表明，饮用常温酸奶28 d(CWd28)后，人群粪便中Lachnospiraceae菌显著降低(P<0.01)，该菌与饮食引起的肥胖具有正相关性[20];饮用L9常温酸奶28 d(L9CWd28)后，人群粪便中[Eubacterium]_hallii_group显著增加(P<0.01)，该菌能够代谢膳食纤维，产生短链脂肪酸[21]。组间比较表明，饮用L9常温酸奶比饮用常温酸奶能显著增加肠道中Blautia(P<0.05)、Ruminococcus_2(P<0.05)和 [Eubacterium]_hallii_group(P<0.01)菌的丰度，Blautia为丁酸产生菌[13],Ruminococcus为短链脂肪酸产生菌[22]。综上可知，L9常温酸奶调节肠道菌群的能力优于普通常温酸奶，主要体现在其增加产短链脂肪酸的菌属。

图3 物种组间差异显著性分析Fig.3 Significantly altered genera analyzed by Student’s t-test

3 结 论

本研究通过人群实验，评价了灭活型副干酪乳杆菌L9常温酸奶通过调节肠道菌群对便秘的缓解作用。测定了短链脂肪酸和肠道菌群，探讨了灭活副干酪乳杆菌L9缓解便秘的原因。结果显示，与饮用普通常温酸奶相比，饮用灭活型副干酪乳杆菌L9常温酸奶后，受试者排便次数显著增加(P<0.05)，排便状况和粪便性状评分极显著降低(P<0.01)；粪便中丁酸含量极显著增加(P<0.01)，丙酸和总酸含量显著增加(P<0.05)；并显著增加产短链脂肪酸的菌属，如Blautia、Ruminococcus_2和[Eubacterium]_hallii_group。研究结果表明，饮用灭活型副干酪乳杆菌L9常温酸奶更有利于提高排便次数，减少排便不适，形成软便，改善粪便的质量，并增加肠道中产短链脂肪酸的菌，因此实现润肠通便的作用。该研究旨在为灭活型副干酪乳杆菌L9在乳酸菌产品中的应用提供科学依据。