高效液相色谱-串联质谱法测定高粱中蜀黍苷的含量

周韩玲，安明哲，李杨华，宋廷富，刘路宏，廖勤俭，王 芳，郭 艳，王小琴，罗 珠

（宜宾五粮液股份有限公司技术研究中心，四川宜宾 644007）

生氰糖苷亦称氰苷、氰醇苷。生氰糖苷是由氰醇衍生物的羟基和D-葡萄糖缩合形成的糖苷，广泛存在于豆科、蔷薇科、稻科的多种植物中[1-2]。苦杏仁苷、亚麻仁苷等都是生氰糖苷的不同形式，存在于高粱中的生氰糖苷则是蜀黍苷[3-5]。

高粱是白酒酿造的重要原料，高粱中的蜀黍苷经β-葡萄糖苷酶水解或者高温酸解之后生成β-D-葡萄糖和不稳定的对羟基-（S）-扁桃腈，对羟基-（S）-扁桃腈在内源性α-羟基裂解酶或碱性条件下分解生成对羟基苯甲醛和HCN[2，6]（图1）。HCN 与白酒中某些物质发生反应生成氰酸盐，氰酸盐进一步与乙醇反应可生成2A 类致癌物氨基甲酸乙酯（图2），研究表明，HCN 是白酒中氨基甲酸乙酯的一种前体物质[7-8]。因此，定量分析酿酒用高粱中的蜀黍苷对于研究白酒中氨基甲酸乙酯的生成机理、提高白酒的品质具有重要的意义。

目前检测生氰糖苷主要方法有液相色谱蒸发光散射法（HPLC-ELSD）[9-10]、液相色谱紫外吸收法（HPLC-UV）[11]和HPLC-MS/MS 法[12]，液相色谱法只依靠保留时间定性，准确性差，灵敏度低，HPLCMS/MS 法以其准确性好、灵敏度高等优势在微量成分含量测定中应用日益广泛。本试验采用HPLC-MS/MS 定量分析高粱中的蜀黍苷，以期为研究白酒中氨基甲酸乙酯生成机理提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

原料：1号高粱、2号高粱、3号高粱，市售。

试剂：甲醇LC-MS 级，Merck 公司；甲酸LCMS级，Fisher公司；蜀黍苷95%，sigma公司。

仪器设备：EksigentekspertultraLC 110 液相色谱仪，美国ABSCIEX公司；5500三重四极杆液相质谱仪，美国ABSCIEX 公司；5810R 冷冻离心机，德国Eppendof 公司；YM-060S 超声波清洗机，深圳市语盟超声波清洗机设备厂；ML 1602 电子天平，梅特勒-托利多公司；AT 201 电子天平，梅特勒-托利多公司；FSJ-Ⅱ 型锤片式粮食粉粹机，中储粮成都粮食贮藏科学研究院；Milli-Q 超纯水制备仪，美国Millipore公司。

1.2 实验方法

1.2.1 液相色谱、质谱分析条件

质谱参数的优化：采用针泵进样方式将浓度为100 μg/L 蜀黍苷标准溶液直接导入质谱仪，采用电喷雾离子源（ESI），分别在正、负模式下进行母离子扫描，根据响应强度确定检测模式和蜀黍苷的母离子；在production ion 模式下进行二级质谱分析，根据离子碎片的响应强度确定定量离子和定性离子；在MRM 模式下，优化定量离子和定性离子的去族电压（DP）和碰撞电压（CE）。

质谱检测条件：检测方式：多离子反应监测（MRM），毛细管电压：5500 V，气帘气：30 psi；碰撞气：8 psi；离子源温度：500 ℃；加热气1：50 psi；加热气2：50 psi。

液相色谱条件：色谱柱：C18柱（100 mm×2.0 mm，3 μ m），流速：0.2 mL/min。柱温：30 ℃。进样体积：3 μL。流动相是本试验要研究的因素，向流动相水-甲醇中添加不同浓度的甲酸、甲酸铵，在不同的流动相下进样分析蜀黍苷标准溶液，考察流动相对质谱信号及峰型的影响。

1.2.2 样品前处理

1.2.2.1 提取溶剂的选择

样品前处理提取溶剂甲醇水溶液浓度是本试验的处理因素。准确称取粉碎均匀的1 号高粱9份，每份1.50 g，分别置于9 个50 mL 离心管中，1～3 号离心管中加入20 mL 纯甲醇，4～6 号离心管中加入20 mL 95%甲醇水溶液（95∶5，v/v），7～9 号离心管中加入20 mL 90%甲醇水溶液（90∶10，v/v），所有离心管低温下超声1 h后8000 r/min离心10 min，吸取上清液0.4 mL，加入0.8 mL 超纯水混匀，经0.2 μ m滤膜过滤后进HPLC-MS/MS分析。

1.2.2.2 高粱颗粒预处理方式的选择及重复性试验

当组织破坏时，高粱中的蜀黍苷存在被酶催化分解的可能，试验中采用超低温研磨法和机械粉碎法对比来确定样品前处理过程中的粉碎方式。超低温研磨法：称取1 号高粱颗粒5 份，每份1.50 g，分别置于研钵中，加入液态氮后快速研磨至细粉状，将研磨好的高粱粉迅速转移到5 支50 mL 离心管中，并加入20 mL 提取液。机械粉碎法：取1 号高粱约500 g，粉碎机粉碎，称取高粱粉5 份，每份1.50 g，置于50 mL 离心管中，加入20 mL 提取液。将10 支离心管于低温下超声1 h，以8000 r/min 离心10 min，吸取上清液0.4 mL，加入0.8 mL 超纯水混匀，经0.2 μ m滤膜过滤后进HPLC-MS/MS分析。

1.2.3 方法学考察

1.2.3.1 线性方程、检出限和定量限

用精度为0.00001 g 的电子天平称取蜀黍苷标准品0.00101 g，以甲醇定容至10 mL，配成浓度为101 mg/L 的储备液（-20 ℃保存），以30%甲醇稀释标准储备液，配制成浓度为10.1 μg/L、20.2 μg/L、50.5 μg/L、101 μg/L、151.5 μg/L、202 μg/L 的系列标准溶液，进HPLC-MS/MS 分析，进行回归分析，得到线性方程和相关系数，并计算检出限和定量限。

1.2.3.2 精密度试验

准确称取1 号高粱粉样品，按照1.2.2 中优化后的方法处理后连续进样6针，计算精密度。

1.2.3.3 加标回收试验

准确称取1 号高粱粉样品6 份，分别加入不同量的标准储备液，按照1.2.2 中优化后的方法处理，进HPLC-MS/MS分析，计算加标回收率。

1.2.4 实际样品的检测

使用粉粹机粉粹2 号高粱、3 号高粱各500 g，分别称取两种高粱粉各1.50 g，经提取液提取，上清液稀释过滤后进HPLC-MS/MS检测含量。

2 结果与分析

2.1 液相色谱、质谱条件优化结果

2.1.1 质谱参数优化结果

采用针泵进样，优化蜀黍苷的质谱参数。采用电喷雾离子源（ESI），在正模式下扫描蜀黍苷的母离子[M+H]+312.2 和[M+NH4]+329.1，在负模式下扫描[M-H]-310.1。结果发现，蜀黍苷的母离子[M+H]+312.2 响应较弱，[M+NH4]+329.1 和[M-H]-310.1响应较好，且在相同浓度下，[M+NH4]+329.1 的信号强度是[M-H]-310.1 的4 倍，因此，最终选择正模式扫描，以[M+NH4]+329.1 作为蜀黍苷的母离子，见图3。在production ion 模式下进行二级质谱分析，结果发现，蜀黍苷母离子[M+NH4]+329.1 的子离子132.1、123.1、180.2、144.9 信号响应均较强，见图4，最终选择[M+NH4]+329.1 的两个特征子离子132.1和180.2 分别作为蜀黍苷的定量离子和定性离子。在MRM 模式下，优化离子132.1 和180.2 的去族电压（DP）和碰撞电压（CE），结果见表1。

表1 蜀黍苷质谱参数优化结果

2.1.2 液相色谱条件优化结果

分别以0.1%甲酸水-0.1%甲酸甲醇、0.05%甲酸水-0.1%甲酸甲醇、0.05%甲酸水-0.05%甲酸甲醇、0.05%甲酸水-甲醇、0.1%甲酸水-甲醇、5 mmoL 甲酸铵-甲醇、水-甲醇作为流动相，进样分析浓度为20.2 μg/L 的蜀黍苷标准溶液。实验结果表明，以水-甲醇作为流动相时，蜀黍苷质谱信号响应最好，因此，最终选择水-甲醇作为本实验的流动相。以0.2 mL/min 的流速，采用表2 中的洗脱梯度进行洗脱时，分离效果较好。

表2 HPLC梯度洗脱条件

2.2 样品前处理方法优化结果

2.2.1 提取溶剂的选择

高浓度醇类物质可使酶的结构发生改变从而失去活性，甲醇能抑制β-葡萄糖苷酶的活性，可避免蜀黍苷在其作用下水解而导致的定量分析不准确，加之蜀黍苷在甲醇中具有良好的溶解性，因此，本试验采用甲醇水溶液来提取高粱中的蜀黍苷。分别以甲醇、95%甲醇水溶液和90%甲醇水溶液为提取液，对粉粹后的1 号高粱中的蜀黍苷进行低温超声提取，上清液经滤膜过滤后进HPLC-MS/MS分析，结果见表3。

从表3 可看出，采用90%甲醇水溶液萃取时，提取液中蜀黍苷测定值较低，其原因可能是提取液中水相比例高，引入了较多的水溶性物质，进而干扰了目标化合物的测定。采用纯甲醇作为提取液时，提取液中蜀黍氰含量略低于采用95%甲醇水溶液作为提取液时所测值，因此，最终选择95%甲醇水溶液作为提取液。

2.2.2 高粱颗粒预处理方式的选择及重复性试验结果与分析

氰苷类植物的氰苷和β-葡萄糖苷酶分别位于不同的细胞中，在正常条件下，氰苷不会被酶水解，而一旦植物组织遭到破坏，就会释放出β-葡萄糖苷酶，在常温潮湿环境下，氰苷会被分解。酶在超低温下其活性会受到抑制，本试验选用液态氮作为β-葡萄糖苷酶的抑制剂，通过超低温（液态氮）研磨法和机械粉粹法两种处理方式的对比，来考察样品粉碎方式对目标化合物含量的影响，见表4。

从表4 可看出，和机械粉碎法相比，液态氮研磨法粉碎的样品提取液中蜀黍苷平均含量略高，但是稳定性极差，5 次平行样测定值的RSD 值高达18.3%，主要原因可能有：（1）液态氮研磨法取样量少，样品均匀性差；（2）处理过程中样品难于研磨均匀，5 次平行样研磨细度很难保持一致；（3）研磨、转移过程中样品可能有一定的损耗。相比而言，机械粉碎法较为稳定，5 次平行样测定值的RSD 仅为2.67%，重复性好，检测值仅比液态氮研磨法低2.0%，说明机械粉碎过程中样品的蜀黍苷未进行大量的水解。同液氮研磨法相比，机械粉碎法操作简单、安全系数高、处理速度较快，且试验成本较低，最终确定采用机械粉碎法，在处理前须进行原样烘干，且在粉碎后应立即萃取或低温保存粉状样品。

2.3 方法学考察结果与分析

2.3.1 线性方程、检出限和定量限

进样分析浓度为10.1 μg/L、20.2 μg/L、50.5 μg/L、101 μg/L、151.5 μg/L 和202 μg/L 的系列标准溶液，以峰面积Y 为纵坐标，以浓度X 为横坐标进行回归分析，得到线性方程和相关系数。将浓度为10.1 μg/L 的标准溶液进一步稀释，以信噪比S/N=3时蜀黍苷的量作为检出限，信噪比S/N=10 时蜀黍苷的量作为定量限，线性关系、检出限和定量限结果见表5。

表3 不同提取液中蜀黍苷含量 (μg/L)

表4 不同处理方式下提取液中蜀黍苷测定结果

表5 线性关系、检出限和定量限

从表5 可看出，采用HPLC-MS/MS 检测蜀黍苷，其浓度在10.1～202 μg/L 时，线性相关好，相关系数（R）不低于0.999，检出限低，灵敏度高。

2.3.2 精密度试验结果

1 号高粱粉样品经处理后连续进样6 针，记录峰面积，经计算，蜀黍苷质谱峰面积的RSD 值为1.04%，精密度良好。

2.3.3 加标回收率试验结果

加标回收试验结果见表6，从表6 可以看出，3个不同水平的加标回收率分别为96.1%、97.9%和90.7%，均位于90%～100%之间，加标回收率良好。

2.4 样品中含量测定结果

采用所建立的检测方法对2 号高粱、3 号高粱中蜀黍苷进行检测，蜀黍苷标准样MRM 色谱图见图5 和图6，采用标准曲线对提取液中蜀黍苷含量进行分析，并进一步计算高粱中蜀黍苷含量，结果表明，2 号高粱和3 号高粱中蜀黍苷含量分别为1.73 mg/L 和2.39 mg/L。浓度为10.1 μg/L 的蜀黍苷标准样品和2 号高粱的MRM 色谱图如图5、图6所示。

表6 加标回收率试验结果

3 结论

本研究对高粱样品的前处理方法、色谱和质谱条件进行了探索和优化，样品经机械粉碎和甲醇水溶液萃取，采用HPLC-MS/MS 测定蜀黍苷含量。依托HPLC-MS/MS 的准确性和高灵敏度，高粱样品粉粹后，经95%甲醇水溶液提取，通过稀释、C18色谱柱分离来降低基质效应，即可准确分析出蜀黍苷含量。本文所建立的检测方法具有前处理简单、易操作、耗时短、灵敏度高、结果精准的特点，适合大量高粱样品中蜀黍苷含量的测定。