中长链脂肪酸结构脂对小鼠脂质代谢的影响

周盛敏，姜元荣

丰益(上海)生物技术研发中心有限公司 (上海 200137)

中国居民营养与健康状况调查显示，与脂肪相关慢性病如超重、肥胖、高血压、糖尿病等增长迅速，主要归结为脂类摄入过多或脂类代谢异常。膳食脂肪主要来源于食用油和食物，两者约各占50%，可见食用油平衡膳食重要性。2016版《中国居民膳食指南》推荐每天烹调油摄入量25～30 g，少吃油，吃好油。于是功能性结构油脂成为研究热点，如中长链脂肪酸结构脂作为一种低能量健康油脂逐渐引起人们的关注。

在我们之前的研究中，已经评估了含有30%(w/w)中链脂肪酸的结构脂在小鼠和大鼠中的安全性，90 d的喂养中，在胚胎毒性和致畸性研究中没有观察到剂量相关的副作用[1]。通过长链甘油三酯(LCT)和中链甘油三酯(MCT)的酯交换制备了不同中链脂肪酸含量(10%、20%、30%，w/w)的结构脂。系统的开展了不同中链脂肪酸含量的结构脂对C57BL / 6J小鼠相应的体重变化，血清相关指标变化，肝脏甘油三酯和肝脏脂质代谢变化等。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

菜籽油，益海嘉里金龙鱼粮油食品股份有限公司；中长链脂肪酸结构脂，丰益研发中心提供；无脂饲料，开源动物饲料(常州)有限公司；RNA样本保存液，英杰公司；甘油三酯和胆固醇试剂盒，上海申索福佑医学诊断有限公司；肝素钠、琼脂糖，上海生物工程有限公司。

1.2 仪器和设备

Genome Sequencer FLX， 罗氏；GC-MS 6973N型，安捷伦；PCR-DGGE，伯乐；全波长多功能酶标仪，赛默飞世尔；ABI 7900 HT荧光定量PCR，赛默飞世尔。

1.3 实验方法

SPF级雄性C57BL/6小鼠，七周龄，适应喂养一周后根据体重随机分为五组，每组12只，共计60只。实验分组如下：低脂组 (LFD)、菜籽油占比4.3%，高脂组(HFD)、菜籽油占比20wt%，低剂量组 (MLCT-L)、10wt%MCFA的MLCT占比20wt%，中剂量组 (MLCT-M)、20wt%MCFA的MLCT占比20wt%，高剂量组 (MLCT-H)、30wt%MCFA的MLCT占比20wt%。小鼠连续喂养6周，记录小鼠每周的摄食量和体重。小鼠禁食16 h后，取血按照商业试剂盒的说明测定血清TC、TG、HDL-C、LDL-C含量[2]，屠宰小鼠、分别称取内脏脂肪如肾周脂肪、附睾脂肪重量及肝脏重量，并测定肝脏TG含量[2]，保留小鼠肝脏组织，液氮速冻后暂存于-80 ℃ 冰箱中备用。

称取30 mg肝脏组织，加入TrizoL 700 μL，低温均质后加入氯仿200 μL，漩涡震荡2 min后，在10 000 rpm转速下冷冻离心15 min。取上清液后提取肝脏组织中的 mRNA(参照Qiagen Rneasy Mini Kit 试剂盒说明)。测定mRNA 的纯度，然后统一反转录，采用 SYBR GREEN 染料法实时荧光定量 PCR，目的基因相对表达量采用2-ΔΔCt方法来计算[3]。

1.4 数据分析

所有试验结果采用 SPSS 21.0和 OriginPro 7.5软件进行数据分析。

2 结果与讨论

2.1 中长链脂肪酸结构脂预防高脂饮食引起的体重增加

经过 6 周喂养，各组每周的食物摄入量没有显著性差异。说明中长链脂肪酸结构脂对于小鼠日常饮食量并没有影响，即MLCT并没有通过影响摄食来减少能量摄入，缓解体重增加。但在体重增加方面 (图 1)，与喂食低脂饲料组相比，由于HFD 组提高了脂肪摄入，导致了6周喂养后HFD 组体重增加明显高于低脂组 (P< 0.05)。在20wt%及30wt%中链脂肪酸剂量MLCT干预下，体重增加相对于高脂饲料组分别减少了40.3%和42.3%，并且中剂量组和高剂量组与高脂饲料组相比有显著性差异 (P< 0.05)，这可能与中链脂肪酸特殊代谢途径有关[4]。可见随着中链脂肪酸含量的增加，其体重的抑制效果越加明显，这个结果也与一些文献报道[5-7]的结论相一致。

图1 MLCT对小鼠体重的重量分析

2.2 中长链脂肪酸结构脂对血清生化指标的影响

小鼠血清生化指标变化如图 2所示，当小鼠摄入 MLCT 后，且随着中链脂肪酸含量的提升，小鼠血清生化指标改善程度越好。高脂饲料喂食组血清总甘油三脂含量显著高于低脂饲料喂食组，添加中链脂肪酸能够降低血清中总甘油三脂含量，在高剂量30wt%中链脂肪酸下达到显著性水平(P< 0.05)。高脂饲料喂食组血清总胆固醇含量显著高于低脂饲料喂食组，添加中链脂肪酸能够降低高脂组血清中胆固醇含量。在10wt%、20wt%、30wt%中链脂肪酸剂量下，血清总胆固醇分别下降了31%、37.9%、51.7%，且三个剂量组均达到了显著性水平。同样地，低密度脂蛋白胆固醇变化趋势与总胆固醇相似。当中链脂肪酸含量达到20wt%和30wt%时，其高密度脂蛋白胆固醇水平显著高于低脂组和高脂组(P< 0.05)。总的来说，高脂饲料喂食相对于低脂饲料喂食导致总甘油三酯和总胆固醇升高更为敏感，而且发现30wt%中链脂肪酸的MLCT可以有效改善小鼠的脂质代谢过程。

图2 MLCT对小鼠血清中总甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇的影响

2.3 MLCT 对内脏脂肪和肝脏甘油三酯的影响

哺乳动物体内脂肪组织主要有两种类型，分为白色脂肪和棕色脂肪，白色脂肪主要以甘油三酯的形式储存能量。图 3a 和 3b是肾周脂肪和附睾脂肪等白色脂肪的变化结果，肾周脂肪和附睾脂肪等内脏脂肪重量随着小鼠摄入中链脂肪酸含量的增加，都逐渐下降，在30wt%中链脂肪酸剂量的MLCT干预下，肾周脂肪和附睾脂肪相对于高脂饲料组分别减少了48%和40.8%，并且达到了显著性水平 (P< 0.05)，同时与低脂组相比没有显著性差异 (P> 0.05)。同样的随着中链脂肪酸摄入量的增加，在20wt%和30wt%中链脂肪酸剂量的MLCT干预下，肝脏甘油三酯相对于高脂饲料组分别减少了23.6%和31.8%，在中剂量和高剂量MLCT作用下，肝脏甘油三酯出现显著降低(P< 0.05)，并且与低脂组相比没有显著性差异 (P> 0.05)。从上面结果可以看出，高剂量的 MLCT可以抑制白色脂肪如肾周脂肪和附睾脂肪累积以及降低肝脏甘油三酯含量。

2.4 MLCT 对小鼠肝组织脂代谢相关基因蛋白表达影响

上述实验发现，随着中链脂肪酸摄入量的增加，小鼠肝脏甘油三酯指标明显改善。肝脏是机体内重要的甘油三酯代谢的器官，肥胖会导致肝组织脂肪堆积、脂肪变性进而导致脂代谢的异常。肝脏内甘油三酯的累积主要由以下几个因素引起：一是脂肪酸摄入增加；二是极低密度脂蛋白分泌减少；三是脂肪酸从头合成[8]；四是脂肪酸β-氧化减少[9]。为了进一步探讨MLCT对小鼠肝脏脂质代谢变化的可能机制，采用实时荧光PCR方法检测了脂代谢相关基因mRNA表达水平。脂肪酸 β-氧化通过过氧化物酶体增殖物激活受体α(Peroxisome prolif-erator-activated receptor α, PPARα) 促进脂肪酸氧化限速酶肉碱脂酰转移酶 (CAT) 的表达和脂酰辅酶 A (ACS) 合成酶的合成，加快脂肪酸氧化分解。如图4所示，β-氧化相关基因包括过氧化物酶体增殖物激活受体α、中链酰基辅酶 A 脱氢酶 (Medium chain acyl-CoA dehydrogenase, MCAD)和长链酰基辅酶 A 脱氢酶 (Long chain acyl-CoA dehydrogenase, LCAD) ，显示出不同的结果。与高脂组相比，低、中、高剂量MLCT组PPARα的mRNA 表达水平显著性上调(P< 0.05)。另外，进入线粒体脂酰辅酶A合成酶被中链酰基辅酶 A 脱氢酶 (Medium chain acyl-CoA dehydrogenase, MCAD)和长链酰基辅酶 A 脱氢酶 (Long chain acyl-CoA dehydrogenase, LCAD)脱氢[8]和β-氧化，在MCAD的mRNA 表达水平上，五个组均没有显著性差异(P> 0.05)。但在LCAD的mRNA 表达水平上，随着中链脂肪酸摄入量的增加，低、中、高剂量组表达水平均显著上调(P< 0.05)，这与Shinohara 等报道的结果相一致[3]。以上表明MLCT组小鼠体内脂肪酸β-氧化降低了肝脏内甘油三脂水平。

图3 MLCT对小鼠肾周脂肪、附睾脂肪、肝脏甘油三酯的影响

图4 MLCT对小鼠肝脏相关基因表达水平的影响

肝脏甘油三脂含量除了受脂肪酸β-氧化分解代谢外，还受肝脏内脂肪酸合成影响。因此分析了控制脂肪酸合成的乙酰辅酶 A 羧化酶 1 (Acetyl CoA carboxylase 1, ACC1)，固醇调节元件结合蛋白 1c(Sterol regulatory element binding protein 1c, SREBP-1c)、苹果酸酶 (Malic enzyme, ME)和脂肪酸合成酶 (Fatty acid synthetase, FAS)[10]。其中，乙酰辅酶 A 向丙二酰辅酶 A 的转变离不开ACC1 酶催化[11]；FAS是多功能同二聚体蛋白，对肝脏中膳食摄入碳水化合物转化为脂肪酸至关重要[12]。苹果酸酯去羧基过程需要ME酶参与，从而释放出丙酮酸和二氧化碳[13]。如图 4所示，在10wt%、20wt%、30wt%中链脂肪酸干预下，ACC1、ME、SREBP-1c、FAS等四个基因表达明显减弱，与高脂组相比，中剂量组和高剂量组明显抑制脂肪酸再合成，达到了显著性水平 (P< 0.05)，表明随着中链脂肪酸摄入，肝脏内脂肪酸合成相关酶表达受到抑制。综上，小鼠摄入 MLCT可以抑制体内脂肪酸合成，增加了肝脏内的脂肪酸 β-氧化，这可以很好的解释了前面肝脏甘油三酯含量的下降。

3 结论

本研究表明， 含有30%(w/w)中链脂肪酸的结构脂可以有效减少脂肪累积，降低体重，改善小鼠的脂代谢和肝脏甘油三酯水平，进一步发现其通过上调肝脏内基因蛋白过氧化物酶体增殖物激活受体α和长链酰基辅酶 A 脱氢酶表达提升脂肪酸β-氧化，且下调脂肪酸合成酶、乙酰辅酶A羧化酶1、固醇调节元件结合蛋白1c和苹果酸酶表达抑制脂肪酸合成。可以推测中长链脂肪酸结构脂是通过调控脂代谢相关基因蛋白表达并伴随着中链脂肪酸特殊代谢途径等共同作用达到防治肥胖目的。