细菌基因工程药物研究进展

徐钟，李远远，王鋆坦，高瑞

(河南省科学院商业科学研究所，郑州 45002)

在长期的进化过程中，人类与共生微生物形成互利共生的关系，共生微生物为人类提供营养，免疫、协助代谢并抵抗病原和有害化合物的侵害[1]。肠道微生物是人体最主要的共生微生物，肠道微生物包含大约10类微生物5000个细菌种类，每个个体的肠道微生物组成多样，其中大约90%的细菌属于拟杆菌门和厚壁菌门，菌群失调会引起各种疾病的产生，并影响终止异常微生物感染的时间[1]。肠道益生菌产生的代谢产物，例如乳酸、抗菌蛋白、多肽、短链脂肪酸和过氧化氢具有控制病菌和预防肠道疾病的作用，研究表明通过益生菌、益生元、抗生素、粪菌移植和饮食干预的方法改变肠道菌群，能够解决肥胖等各种复杂的肠道疾病[1]。某些肠道微生物展现出天然的药性，例如肠道菌群失调将引起肥胖和二型糖尿病等代谢性疾病，这类病人肠道中丁酸盐产生菌的比例降低，而丁酸盐产生菌嗜黏蛋白-艾克曼菌(Akkermansia muciniphilia)对糖尿病小鼠有良好的治疗效果，因此，降糖药物二甲双胍可以通过影响肠道黏膜内壁的嗜黏蛋白-艾克曼菌，达到治疗肥胖和二型糖尿病的效果[2]。

1 细菌活体药物

目前，小分子化学药物和蛋白类大分子药物在医药研发中占据主导地位。小分子化学药物稳定性及生命周期长，便于储存运输，但副作用明显且会产生耐药性；蛋白类大分子具有更高的靶点特异性和更小的副作用，但开发成本高，生命周期短。相对于小分子化学药物和蛋白类抗体药物，微生物具有操作简单且筛选便利的优势。通过基因改造可以将微生物变成能持续产生具有疾病治疗效果的药物，利用某些微生物能在特异组织和器官中富集的特性，增加药物疗效并减少副作用[3]。微生物活体药物的设计中，底盘生物必须是具有较好的遗传操作性的非致病菌，且在发挥疗效的部位天然存在。目前，理想的底盘益生菌有乳酸菌、双歧杆菌和E.coliNissle1917(EcN)等，尽管这些微生物本身的治疗作用有限，但他们的安全性已经被充分认可[4]。因而，通过对这些益生菌进行理性的基因工程设计，开发出能发挥各种有益性状的菌株，赋予他们对抗疾病的性能，可以将肠道益生菌应用到更广的健康领域。

1.1 乳酸菌活体药物

乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)是一类能利用葡萄糖或乳糖发酵产生乳酸的非致病性食品级微生物，与人共生的LAB具有降低潜在神经毒性化合物(例如氨、胺和吲哚)的功效[5]，有助于抵抗阴道细菌感染和抵抗其它性传播疾病(例如人乳头瘤病毒和HIV病毒)感染。以LAB作为表达抗生素和抗体的宿主，用于治疗性病传播有以下优势：(1)乳酸菌在泌尿生殖器和肠道中天然存在，使用时不会在黏膜表面产生拮抗作用；(2)便于定植，能够达到持久保护的效果。

疫苗类药物不能在黏膜组织诱导出足够的免疫反应，对黏膜感染的治疗效果差。采用LAB作为载体，通过口服既能避免被肠道消化又能将具有免疫调节作用的因子递送到炎症部位，达到治疗的目的[6-7]。此外，LAB还可以通过抑制病原菌在宿主肠细胞上的附着，预防微生物感染性疾病[6-7]。2000年Steidler等[8-9]采用乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)表达人源的抗炎症性细胞因子白介素IL-10治疗克罗恩病(Crohn'sdisease)，这是最早的活体微生物工程药物，已经通过了I期的临床试验。随后有多种基于LAB的生物工程菌株被开发，并在动物模型和人的临床试验中被证实能起到改善病症的效果(表1)。

1.2 大肠埃希菌EcN活体药物

大肠埃希菌EcN是德国细菌学家Nissle在20世纪20年代从志贺菌痢疾爆发的健康士兵的粪便中分离出来的，具有治疗腹泻的功效，是目前被广泛应用的益生菌[24]。大肠埃希菌具有遗传操作上的优势，Synlogic公司以EcN为底盘生物，开发各种用于治疗炎症性肠道病、癌症以及代谢缺陷性疾病的微生物工程药物[25-26]，例如：用表达线虫半胱氨酸蛋白酶抑制因子的EcN治疗炎症性肠道疾病[25]；用表达乙酰化磷脂酰乙醇胺的EcN和表达瘦素的EcN长效预防肥胖病[26]。此外，具有特殊功能的肠道益生菌能辅助疾病治疗，例如，由于尿毒症患者肠壁通透性增强，外排功能减弱，肠道微生物产生的毒素(例如硫酸吲哚酚、马尿酸和苯乙酸)加剧毒素的积累[27]，通过口服表达脲酶的EcN，降解毒素，减轻尿毒症症状，该疗法已经在小鼠模型中得到证实[28]。

表1 用于疾病治疗的LAB基因工程菌株

在病原菌防治方面，EcN工程菌株也能发挥重要作用，例如：利用铜绿假单胞菌群落感应因子诱导表达的抗菌肽microcin S和核酸酶DNaseI的EcN，定向杀灭致病菌[29-30]，以减少抗生素使用和细菌耐药性的产生；利用EcN表达分泌型的HIVgp41-hemolysisn阻止HIV与细胞的结合，帮助宿主抵抗HIV感染，在小鼠模型中被证实能发挥抗HIV功效[31]；采用EcN表达霍乱自诱导分子CAI-1，能显著降低霍乱的致病性[32]。

1.3 其它活体细菌药物

一些具有特殊生理功能的细菌也能作为疾病治疗的药物，例如通过基因工程的方法让能在肿瘤中聚集的细菌(例如梭状芽孢杆菌、鼠伤寒沙门菌)携带肿瘤治疗药物，进行靶向用药，以提高治疗效果，同时减少由于药物对健康细胞的毒害作用引起的不良反应[33]。利用细菌的肿瘤趋向性和向细胞转运DNA的能力，在细菌中表达具有肿瘤杀灭作用的蛋白，诱导细胞凋亡的配体，小分子干扰RNA(RNAi)或产生有毒化合物的生物酶(胞嘧啶脱氨酶和HSV-tk)，治疗癌症，例如根据李斯特菌对免疫系统敏感，只能在免疫抑制的肿瘤组织中存活的特性，通过在抗李斯特菌的抗体上加上放射性的铼元素，用于检测和杀灭癌细胞[34]。

此外，一些肉食性细菌也能够通过吞噬特定病原菌，起到噬菌体类似的治疗效果，具有活体药物开发潜力，例如以革兰阴性菌为食的食菌蛭弧菌Bdellovibrio bacteriovorus和Micavibrioaeru ginosavorus，具有治疗肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)的效果[35]。

2 效应物表达调控及微生物封存技术

2.1 效应物分子的表达调控

在疑难杂症，例如癌症和代谢疾病的治疗中，传统的治疗方案往往受限，因为不同病人的病况不同并随时变化，现代医学提倡根据病人的遗传信息制订个性化的治疗方案。微生物工程菌可以将诊断和治疗过程整合到一个系统中，在疾病发生时，在病灶部位实现体内药物分子的合成和运输。该系统的优点：①由于药物分子只出现在病灶组织附近，实现用药量的最小化，减少药物的副作用；②药物分子能够在病灶部位持续产生，延长药物的半衰期，达到最优的治疗效果；③通过在该系统中加入只在病灶组织中表达报告基因，能够实时监控病情发展。利用微生物的转移、信号转导、合成和分泌等自然能力，开发用于疾病治疗的工程菌株，需要对微生物的这些功能元件有充足的认识。目前的生物学研究，已发现大量的对细胞内或细胞外特定外界刺激起应答反应的生物传感元件[36]，通过这些元件组装出能够精确调控效应分子表达的工程菌株，对开发新型的体内生物治疗方法具有重要意义。

2.2 工程菌株的封存

在用微生物进行疾病治疗中，安全性是最重要的考虑因素，尽管益生菌在疾病治疗中有多方面的优势，但是针对不同人群也可能产生一些副作用，例如，过激的免疫应答反应、有害的次级代谢产物、基因突变以及引起肠胃疾病等[37-38]。与用于生产的工程菌不同，用于疾病治疗的工程菌在临床的开放环境中，可能会对正常的个体产生影响，因此这类菌株的设计需要考虑多方面因素，例如不携带多余的抗性基因，效应物分子的表达可控，菌株的生存环境可控。基因改造的微生物在展示疾病治疗潜力的同时，也会在人群中传播，出现生物污染问题，因此，基因工程菌株的设计必须具有预防生物逃脱的应用机制。

在开放环境中，需要阻止用于工程微生物的意外进化，水平基因转移和向环境中扩散。为此，科研人员开发出了几种基于营养缺陷型的微生物封存技术。第一种封存技术采用来自施氏假单胞菌WM88的亚磷酸转运系统HtxBCDE，该转运系统能转运亚磷酸而不能转运磷酸，通过敲除工程菌株的总磷酸和有机磷酸转运系统，并表达HtxBCDE和亚磷酸脱氢酶，让亚磷酸作为该菌株能够利用的唯一磷源，而环境中的亚磷酸不足以维持细菌生长，因此，该工程菌株只能在补充亚磷酸的条件下生存[39]。第二种封存技术采用人工设计的氨酰t-RNA合成酶(BipARS)改变工程菌株的密码子读取，让UAG密码子加载非天然氨基酸NSAA L-4,49-biphenylalanine(BipA)，当没有BipA底物时，工程菌株生存的必需基因无法表达，所以不能存活[40]。第三种封存技术采用宿主细胞的功能元件，弥补工程菌株的基因缺陷，使工程菌株只能在特定宿主细胞中存活，例如敲除牛痘病毒的胸苷激酶合成基因，胸苷激酶为病毒DNA复制提供核苷酸，胸苷激酶在正常细胞的特定细胞周期表达，而在许多癌症细胞中成型表达，因此敲除胸苷激酶合成基因的牛痘病毒能选择性地在肿瘤细胞中高效复制[41]。

3 结论与展望

近年来的研究表明，肠道益生菌与人体的营养代谢、机体发育、免疫力和多种疾病的发生密切相关，这些益生菌通过辅助消化，产生各种代谢产物，以及直接与人体肠道细胞的接触方式发挥作用[42]。基于肠道益生菌与人体稳定共生，能在特异组织(肿瘤)或器官中富集，以及具有可遗传操作的特性，对益生菌进行基因工程改造，将生物药物的合成基因导入特定的益生菌中，并对其效应物分子的表达和菌株的生存进行精细的调控，构建的益生菌基因工程菌株将具有持续的疾病治疗、预防以及监测的效果(图1)，极大的降低了一些慢性疾病的治疗费。

图1 细菌工程药物设计流程

利用活体微生物预防和治疗疾病已经实现了临床应用并使部分病人受益，但是一些治疗效果不理想，个体差异导致的治疗不确定性，还需要进一步研究阐明原因，特别是目前还没有这类药物的使用标准和疗效评价体系。出于抗耐药病原菌新药和个性化治疗药物的需要，微生物活体药物具有巨大的市场价值和应用前景。选择何种效应物分子、运载效应物分子的活体微生物、用药方式、效应物分子的表达调控以及工程菌株的封存，是活体微生物药物研究的需要考虑的问题。目前成功的噬菌体、细菌和病毒活体工程药物研究，为进一步推动更多活体微生物药物进入临床治疗奠定了基础。