开口导管比例对栓塞脆弱性曲线类型的影响*

赵 涵 黄 瑾 张友静 鲁彦君 姜在民 蔡 靖,3

(1. 西北农林科技大学林学院 杨凌 712100； 2. 西北农林科技大学生命科学学院 杨凌712100； 3. 陕西秦岭森林生态系统国家野外科学观测研究站 杨凌 712100)

植物的生存生长离不开木质部管道的水分运输，内聚力-张力理论认为，水分不断向周围大气中蒸腾散失而产生的木质部负压使植物水分运输处于亚稳态(Dixonetal., 1895)。这种状态下的木质部管道内的水柱容易被气泡打断，植物处于发生栓塞的风险中(Sperryetal., 1988)。植物在干旱胁迫下，木质部压力(木质部水势)更低，输水管道更易发生栓塞。栓塞的管道失去输水功能，使植物遭受到不可逆的伤害。干旱胁迫诱导的栓塞已被认为是干旱引起植物死亡的主要原因之一(Brodribbetal., 2010; Choatetal., 2018; Urlietal., 2013)。当今，气候变化引起极端干旱多发，研究植物抵抗栓塞、适应干旱的能力具有重要意义。

植物抵抗栓塞的能力已成为评估植物耐旱性的重要指标，这可通过栓塞脆弱性曲线(vulnerability curve，以下简称VC)来反映，它描述的是木质部水势与栓塞程度的关系(Tyreeetal., 2002)。VC的建立方法有多种，常用方法主要有自然干燥法(Sperryetal., 1988)、离心机法(Alderetal., 1997; Cochard, 2002; Cochardetal., 2005; Pockmanetal., 1995)、压力套法(Cochardetal., 1992; 2013a)。其中，离心机法的原理是用离心力模拟活体植物中的木质部负压，通过不断增大离心力来诱导枝条产生栓塞并测定其导水率损失，利用该方法能够在2 h内产生一个完整的栓塞脆弱曲线，具有操作简单、省时省力的优点，目前已成为建立VC的主要手段之一。根据装置设计不同，离心机方法分为多种，主要区别在于栓塞程度测定方式不同。其中Cochard发明的Cavitron离心技术相比于其他离心机法，可以同步进行栓塞诱导和栓塞程度测定，仅使用1根枝条就能构建完整的VC，更加省时(Cochard, 2002)。根据VC形状特点，可大致分为3种类型，即“s型”、“r型”及介于二者之间的“中间型”(Cochardetal., 2013a)。其中，“s型”VC指的是栓塞程度在木质部水势下降到临界值之前几乎为零，这个临界值往往小于植物日常生长中经历的最小木质部水势(正午时的水势)，曲线在此临界值之前表现为非常平缓，只有当木质部水势降低到临界值之后才逐渐发生栓塞，随着水势的降低，曲线变得陡峭，表明导水率损失急剧增大，栓塞程度增加。然而“r型”曲线没有栓塞发生的临界值，木质部水势从零稍降低之后，栓塞程度即陡然增加，曲线表现为一开始就十分陡峭(图1)。目前，绝大多数学者认为离心机建立的“s型”VC可真实反映植物的栓塞脆弱性，而离心机建立的“r型”VC的真实性则存在很大争议，认为“r型”VC不符合植物的水分关系，严重高估了栓塞脆弱性(Choatetal., 2010; Martin-StPauletal., 2014; Wangetal., 2014)。应用离心机法，导管比较短的散孔材树种主要呈现“s型”VC，而导管比较长的环孔材树种主要呈现“r型”VC(Cochardetal., 2013a)。

图1 木质部栓塞脆弱性曲线(VCs)示意

对离心机法建立的“r型”VC成因探究中，前人认为长导管树种的VC存在因“开口导管”造成的栓塞假象，即当被测植物最大导管长度超过离心机转子长度时，切取的离心枝条中就会不可避免地出现无导管端壁的两端开口的导管(图2A中黑点填充的导管)或者开口到离心机转子中心的导管(图2A中黑色填充的导管)。目前，开口导管造成栓塞假象的物理机制尚未有定论，Cochard等(2005； 2010)认为在开口导管中，由于没有导管端壁或纹孔膜的过滤，导管中的小气泡或杂质微粒会向负压最小的转子中心移动，最终聚集成核，在木质部负压较大时就会引发导管空穴化(图2B)，从而使导管丧失导水功能，如果开口导管占到一定比例就会使离心枝条木质部负压较大时表现出较大程度的栓塞，从而高估了植物的栓塞脆弱性。然而，导管较短的散孔材离心枝条大多数导管是具有2个端壁的完整导管(图2中灰色填充的导管)，导管端壁上的纹孔膜可以过滤掉微小气泡或杂质，阻止其向中心点移动，避免了较早栓塞。近10年来，越来越多的实验证据证实了栓塞假象的存在，，但多集中在离心机法与其他方法建立VC的比较(Choatetal., 2010; Jacobsenetal., 2012; McElroneetal., 2012; Tobinetal., 2013; Torres-Ruizetal., 2014; Yinetal., 2019)、同种植物不同样本长度对离心机VC影响的检验(Cochardetal., 2010; Sperryetal., 2012)、假象成因的探究(Lopezetal., 2019; Pivovaroffetal., 2016; Wangetal., 2014)等方面。在种间水平探究开口导管比例的多少对VC类型的影响，还未见报道。

图2 离心枝条开口导管情况示意

本研究以9种具有不同导管长度的树种为对象，采用Cavitron离心机法建立栓塞脆弱性曲线，采用注气法测定导管长度，探究开口导管比例与VC曲线类型的关系，以验证“开口导管”造成的栓塞假象，为离心机法评估植物栓塞抗性的可靠性提供参考，从而更准确地评估植物抗栓塞能力的大小，为生态建设中抗旱树种的选择提供可靠依据。

1 研究区概况

研究区位于西北农林科技大学校园内(34°16′N，108°07′E)，海拔457 m，地处陕西关中平原中部，暖温带半湿润半干旱气候，年均气温12.9 ℃，无霜期221天，年均蒸发量884 mm，年均降水量651 mm。

2 材料与方法

2.1 试验材料

2018年10—11月，选取生长于西北农林科技大学校园和苗圃内的9种生长良好的乔木树种： 刺槐(Robiniapseudoacacia)、桑(Morusalba)、紫薇(Lagerstroemiaindica)、女贞(Ligustrumlucidum)、桃(Amygdaluspersica)、沙棘(Hippophaerhamnoides)、元宝槭(Acertruncatum)、榛(Corylusheterophylla)、秦白杨[Populusalba‘I-101’× (P.alba×P.glandulosa‘84K’)]。于清晨采集当年生或1年生枝条(基部直径至少为6 mm，长度至少为1 m)，将其装入带有湿纸的黑色塑料袋，在30 min内带回实验室。

根据Cavitron离心机转子直径(27.4 cm)，将9个树种分为3类： 长导管树种(平均导管长度>15 cm，刺槐、桑、紫薇)、中导管树种(平均导管长度10～15 cm，女贞、桃、沙棘)和短导管树种(平均导管长度<10 cm，元宝槭、榛、秦白杨)。

2.2 研究方法

2.2.1 栓塞脆弱性曲线(VC)的建立 应用改进的Cavitron离心机(ChinatronH2100R, 湘仪离心机仪器有限公司, 湖南, 中国)建立VC，具体方法参考Cochard(2002)、Cochard等(2005)和Wang等(2014)。先在水下切割基部直径5.5～7.5 mm、长度274 mm的枝条茎段，用锋利的单面刀片将切口修整平滑，再用经过抽真空脱气和净化处理的0.1 mol·L-1KCl溶液在0.12 MPa下冲洗30 min，然后迅速将茎段两端浸入装有0.1 mol·L-1KCl溶液的比色杯中，置入离心机，在1 000 r·min-1转速(相当于木质部水势=-0.088 3 MPa)下离心20 min，测定最大导水率(Kmax)。逐步升高转速获得从高到低的一系列水势值，每个转速下稳定2 min后测定导水率(Kh)，计算导水率损失百分数(percentage loss of hydraulic conductivity, PLC)：

PLC=(1-Kh/Kmax)×100%。

(1)

当PLC值达到95%以上时可视为导管完全栓塞，离心结束。将得到的木质部水势值(Ψ, MPa)与对应的PLC值用单威布尔函数(公式2)或双威布尔函数(公式3)拟合得到VC。

(2)

(3)

式中： λ，b，c，b1，c1，b2，c2均为参数。λ值为第1条威布尔曲线所能达到的最大PLC值； 当Ψ的绝对值等于b值时，公式(2)的左边恒等于0.632，故而b值等于PLC为63.2%时对应的木质部水势的绝对值，b值越大代表植物栓塞脆弱性越小；c值为形状参数，代表着曲线在b值点的斜率，c值越大表示曲线在b值点的斜率越大，曲线越陡峭(Neufeldetal., 1992; Lietal., 2008; Caietal., 2010)。

在植物水力学研究中，通常使用P12、P50、P88(分别对应导水率损失12%、50%、88%时的木质部水势)描述植物的栓塞脆弱性，P12可定义为栓塞起始点水势值，P50为木质部输水功能障碍点水势值，P88为栓塞致死点水势值(Sparksetal., 1999; Domecetal., 2001; Fichotetal., 2015)。对于单威布尔函数拟合的VC，分别使用公式(4)—(6)计算P12、P50、P88：

P12=b(-ln0.88)1/c；

(4)

P50=b(-ln0.5)1/c；

(5)

P88=b(-ln0.12)1/c。

(6)

式中：b和c为单威布尔函数拟合得到的参数。

对于双威布尔函数拟合的VC，使用EXCEL中的单变量求解功能计算P12、P50、P88。

每个树种重复6根枝条。

2.2.2 导管长度的测定 导管长度测定采用注气法，具体操作方法见张玲玲等(2016)。将采集的枝条基部用锋利的刀片修整平滑后连接到塑料软管上，在0.1 MPa压力下注入空气，枝条末端浸入水槽中，并在水下用修枝剪连续剪掉2 cm长度的茎段，直至枝条末端出现第1个气泡，此时剩余的枝条长度即为最大导管长度(Lmax)。适量剪短枝条以使枝条排出更多气泡(视树种而异)，记录剩余的枝条长度(x)，用排水法收集枝条末端排出的气体(V)，记录收集的时间(t)，计算单位时间内气体体积流量(即流速Q=V/t)。连续剪短一定长度的茎段(视树种而异)，获得一系列的Q值。将乘积Qx的自然对数值与x进行线性回归，得到斜率k。每个树种重复6根枝条。则平均导管长度Lv=-2/k。导管长度概率密度分布函数为：

P(x)=k2xekx。

(7)

式中：x为茎段长度，k为斜率。

距离离心枝条一端xcm处的开口导管比例可以通过下式计算：

F(x)=(1-kx)ekx。

(8)

式中：x为茎段长度，k为斜率。

根据公式(8)计算两端开口的导管(x=27.4 cm，图2A中黑点填充的导管)和开口至转子中心的导管(x=13.7 cm，图2A中黑色填充的导管)的比例，分别记为F27.4和F13.7。

2.2.3 数据处理 使用SPSS 22.0进行单因素方差分析(ANOVA)，在0.05水平采用Turkey法进行多重比较，检验9个树种的栓塞脆弱性、最大导管长度、平均导管长度以及开口导管比例的差异显著性。使用Pearson法在0.05水平检验栓塞脆弱性和开口导管比例是否显著相关。

3 结果与分析

3.1 栓塞脆弱性曲线(VC)类型和栓塞脆弱性

长导管树种(刺槐、桑、紫薇)和短导管树种(元宝槭、榛)的栓塞脆弱性曲线可使用单威布尔函数良好地拟合，中导管树种(女贞、沙棘、桃)和短导管树种秦白杨的VC使用双威布尔函数拟合的精度更高，具体拟合参数值见表1。长导管树种中，刺槐和桑的VC呈现“r型”，紫薇的VC呈“s型”(图3A)。刺槐和桑的PLC值增长很快，分别在-0.3 MPa和-0.5 MPa时达到50%的PLC(表2)。虽然紫薇的P12和P50值比刺槐和桑更低，但是紫薇的威布尔函数c值更大，VC趋势更陡峭，说明其导水率损失速度更快。中导管树种均呈现由2条“s型”曲线组成的双威布尔曲线(图3B)，女贞和沙棘的VC相似，第1条“s型”曲线比第2条“s型”曲线更陡峭，说明女贞和沙棘开始时导水率损失速度很快，分别达到48.67%和55.73%的PLC后(表1中的λ值)，导水率的损失速度变慢，女贞和沙棘分别在-6.40 MPa和-4.16 MPa时达到88%的PLC(P88值，表2)。中导管树种桃VC不同于沙棘和女贞，其VC虽然可以用双威布尔函数拟合，但是，第1条“s型”曲线能达到的最大PLC仅为12.45%，更接近于单威布尔“s型”，栓塞发生的木质部水势临界值(P12=-2.11 MPa)显著低于沙棘和女贞(表2)。桃双威布尔函数c2值显著大于女贞和沙棘，P88值显著低于女贞，说明导水率损失的速率比女贞和沙棘更快。短导管树种元宝槭和榛的VC均呈“s型”(图3C)，即当木质部水势降低到一定临界值(P12)时才开始发生栓塞，在此临界值之前几乎不发生栓塞。而秦白杨的VC不同于元宝槭和榛，呈现由2条“s型”曲线组成的双威布尔曲线(图3C)。短导管树种中秦白杨的P12、P50、P88值均为最大，P12值显著高于元宝槭和榛(表2)，说明秦白杨的栓塞脆弱性最大，其次为榛，元宝槭的栓塞脆弱性最小。

表1 9个树种栓塞脆弱性曲线拟合参数(均值±标准误)①

①不同小写字母代表存在统计学显著差异(P< 0.05)。下同。The different lower cases indicate statistically significant difference (P< 0.05).The same below.

表2 9个树种的栓塞脆弱性(均值±标准误)①

①P12、P50、P88分别代表导水率损失12%、50%、88%时对应的木质部水势值。下同。P12,P50,P88represent xylem water potential causing 12%，50%，88% hydraulic loss, respectively. The same below.

图3 9个树种的栓塞脆弱性曲线

3.2 导管长度与开口导管比例

9个树种中，最大导管长度(Lmax)最大的3个树种是桑、紫薇和女贞(> 80 cm)(图4)。长导管树种刺槐的Lmax与中导管树种桃和沙棘无显著性差异(均在60 cm左右)。在短导管树种中，Lmax最大的是秦白杨，约40 cm，显著高于榛和元宝槭(均小于20 cm)。长导管树种中平均导管长度(Lv)最大的是刺槐和桑，显著高于紫薇，3个树种的Lv值均在16 cm以上。中导管树种的Lv值没有表现出差异性(均在13 cm左右)，且均显著小于长导管树种。短导管树种的Lv值均小于5 cm，显著小于长导管和中导管树种，其中元宝槭和桃的Lv值无显著性差异，但显著低于秦白杨。长导管树种刺槐和桑的导管长度概率分布模式相近，大于27.4 cm的导管概率累积值较紫薇更大(图5A)。中导管3个树种导管长度概率分布模式均相近，绝大多数导管长度在27.4 cm以下(图5B)。短导管树种中榛和元宝槭的导管长度概率分布模式相近，绝大部分导管在5 cm以下，秦白杨的导管长度分布更广(图5C)，5 cm以上的导管依然占据了很大比例(39%左右)。

图4 9个树种的平均导管长度(Lv)和最大导管长度(Lmax)

长导管树种27.4 cm处的开口导管比例(F27.4)达20%左右，13.7 cm处的开口导管(F13.7)达60%左右，其中刺槐和桑的开口导管比例最大，显著高于其他7个树种(图6)。中导管树种F27.4达10%左右，F13.7达40%左右，3个树种均无显著性差异。短导管树种的F27.4均小于0.1%，秦白杨的F13.7最大(2.68%)，但3个树种均无显著性差异。

3.3 开口导管比例和栓塞脆弱性的关系

开口导管比例与栓塞脆弱性显著相关(图7)。除P88外，F27.4和F13.7与P12、P50均有显著正相关性(P< 0.05)，即开口导管比例越多，植物栓塞脆弱性越高。F27.4、F13.7与P50的相关性均最强(图7B、E)，而与P88相关性均不显著(图7C、F)。

图5 9个树种的导管长度分布

图6 9个树种两端开口的导管(F27.4)和开口至转子中心的导管(F13.7)的比例

4 讨论

本研究显示，9个树种的P12、P50值与开口导管的比例显著相关，说明开口导管比例的多少能显著影响栓塞脆弱性。“气种”假说(air-seeding hypothesis)(Sperryetal., 1988)和“纹孔面积”假说(Christmanetal., 2009)认为，植物木质部栓塞脆弱性大小主要由木质部解剖结构特征决定，尤其是导管或管胞之间的纹孔膜性质。种间比较发现，P50值与纹孔膜面积(Wheeleretal., 2005; 张海昕等, 2013)、纹孔膜上微孔的大小(Jansenetal., 2009)、纹孔膜厚度(Lietal., 2016)显著相关。开口导管数量不是木质部固有的结构特征，是人为切割离心枝条造成的，如果开口导管的数量能显著改变VC的类型，进而影响植物栓塞脆弱性测定的真实性，那么通过离心机法测定的栓塞脆弱性可能存在开口导管造成的栓塞假象。

图7 开口导管比例与栓塞脆弱性的关系

多数学者认为，“r型”VC存在“开口导管”引起的栓塞假象，但是存在开口导管并不一定会导致“r型”VC的产生，二者不能混淆。开口导管栓塞假象的生理学依据是，植物的栓塞脆弱性曲线反映出的栓塞起始点的木质部水势远高于植物日常生存所经历的水势范围(Cochardetal., 2013b)。这意味着植物必须在每天的生存生长中经历很大程度的栓塞。目前，尽管有学者认为植物可以通过某种机制进行主动的日常栓塞修复，但是这些栓塞修复假说缺少有力实验证据(Sperry, 2013; Wheeleretal., 2013)。多数学者认为植物日常经历的水势范围应高于发生栓塞的木质部水势临界值，因此，正常生长的植物不会经历频繁的栓塞。当面临水分胁迫时，植物可以通过气孔调节机制调节水势，缓解水分胁迫压力，保障植物的主要水力系统不受伤害(Hochbergetal., 2017; Liuetal., 2015; Martin-StPauletal., 2017; Martinez-Vilaltaetal., 2017; Tombesietal., 2014; 2015)。本研究中，只有长导管植物桑和刺槐的VC展示出“r型”(图1A)，但是并不能认为只有这2个树种具有开口导管造成的栓塞假象。本试验研究区生长季一天中最低水势小于-1 MPa[参考Wang等(2014)中的Fig.3a]，将-1 MPa代入公式(2)或公式(3)可以得到各树种在-1 MPa下的PLC。紫薇在此水势下的PLC高达94.58%，超过了致死栓塞程度(88%)，水力系统几乎完全丧失功能，所以尽管紫薇的VC呈现“s型”，但是其VC真实性也要受到质疑。中导管树种沙棘在此水势下的PLC为45.53%，女贞为29.09%，二者VC呈现双威布尔的“中间型”，虽然少有研究质疑“中间型”曲线的真实性，但这类曲线依然有待进一步检验。中导管树种的F27.4较少，只有10%左右，而F13.7却达到了40%，具有这种高比例F13.7的树种往往会产生“中间型”曲线(Lopezetal., 2019)。然而中导管树种桃虽然开口导管比例与沙棘、女贞无异，但是其VC类型更接近于“s型”。桃的木质部栓塞起始水势小于-2 MPa，日常水分运输相对安全，这似乎符合植物的水分关系。Yin等(2019)采用Cavitron离心机、Sperry离心机、自然干燥法建立了桃的脆弱性曲线，发现3种方法建立的VC一致，并提出桃虽然有一定比例的开口导管存在，但其VC也是可信的。然而，本研究中，桃枝条在离心测定前，枝条基部分泌的桃胶可能会堵塞导管，也包括开口导管，离心开始时测定的初始导水率已不包含这部分堵塞导管的导水贡献，这就可能减轻了开口导管造成的影响。

长导管树种紫薇VC呈现“s型”，不同于刺槐和桑，但其栓塞发生的临界值为-0.61 MPa，大于植物日常经历的最小水势值，这可能与离心机测定时的起始负压有关。Cavitron离心机产生的离心力有两方面作用： 一方面是产生诱导栓塞的负压，一方面是产生驱使水分在枝条内流动的压力差(Cochard， 2002)。离心枝条最大导水率的测定需要在较高负压下进行，该负压还未能诱导产生栓塞，但Cavitron离心机法测定VC的起始负压值并没有固定要求，在实际操作中可视具体情况而定，如Cochard等(2005)设定的起始负压值为-0.5 MPa，Martin-StPaul等(2014)设定为-0.1 MPa，Yin等(2019)设定为-0.083 MPa。若将建立紫薇VC的起始负压设定为-0.5 MPa，可能会改变VC类型，成为“r型”。同样地，若将双威布尔VC树种的起始负压也设定为-0.5 MPa，双威布尔的第1段“s型”曲线可能会变成“r型”。

短导管树种中秦白杨的VC异常于元宝槭和榛，这也许与其存在少量比例的开口导管有关。Cai等(2010)使用Cavitron离心机得到了美洲山杨(Populustremuloides)的“s型”VC，并推断出离心机法更适合建立平均导管长度小于3.8 cm的树种的VC。美洲山杨的平均导管长度在3 cm左右，本研究中，元宝槭和榛的平均导管长度均小于3.8 cm，其VC均呈现“s型”，这符合Cai等(2010)的推断。秦白杨的平均导管长度大于3.8 cm，曲线呈现2条“s型”曲线组成的双威布尔形，这可能与其相对较长的导管有关。Lopez等(2019)建立CAVITOPEN模型定量模拟了开口导管对于离心机VC的影响，发现只要存在开口导管就会造成离心机VC的栓塞假象，即使在短导管树种中，被切开的导管也会在较高的负压下造成导水率部分损失，形成双威布尔形曲线，而且开口导管越多，双威布尔曲线的“λ值”就会越大，当“λ值”较大时(如大于80)，VC就呈现“r型”。如Wang等(2014)使用单威布尔函数和双威布尔函数拟合了刺槐的VC，发现双威布尔拟合效果更佳，但双威布尔曲线的第2段曲线只能解释22%的PLC(λ值为78)，所以曲线类型近似单威布尔“r型”。同样地，本研究的结果也支持了Lopez等(2019)建立的CAVITOPEN模型，如果不考虑特殊的桃，随着导管长度增大，开口导管增多，λ值也在变大，曲线由“s型”变成“中间型”，最后变成“r型”。

由于技术限制，大多数植物栓塞脆弱性的研究技术(如离心机法、压力套法、自然干燥法)是利用离体植物组织或器官进行，这些方法或多或少都会存在人为假象。近年来，随着技术进步，X射线显微断层摄影技术(X-ray microtomography, microCT)(Choatetal., 2016; Cochardetal., 2015)与核磁共振成像技术(magnetic resonance imaging, MRI)(Choatetal., 2010)实现了对完整活体植物栓塞水平的无创检测，既精确评估了植物的栓塞脆弱性，又为其他方法的评价提供了参考依据。Lopez等(2019)利用microCT技术证明离心枝条的两端栓塞最多(开口导管引起的栓塞假象)，转子中心部分因为完整导管最多，所以栓塞最少。未来的研究需要利用这些新技术更全面地阐释开口导管形成栓塞假象的物理机制。

5 结论

本研究在种间水平验证了开口导管比例能显著影响Cavitron离心机法建立的栓塞脆弱性曲线类型，当开口导管比例极少时，脆弱曲线呈“s型”，随着开口导管比例增多可能会造成“r型”曲线以及介于“s型”与“r型”之间的“中间型”曲线。此结论进一步支持了开口导管栓塞假象的假说，为Cavitron离心机法测定栓塞脆弱性时的树种选择提供了理论依据。为获得可靠的栓塞脆弱性数据，基于本研究，建议使用Cavitron离心机法前，先测定树种的导管长度，计算离心枝条开口导管比例，最后选择开口导管比例极少的树种进行测定。