血清长链非编码RNA CRNDE在鼻咽癌中的表达及临床应用价值

潘国刚，王春芳，黄春传，梁丽娜，许桂丹，邓益斌(右江民族医学院附属医院检验科，广西百色 533000)

鼻咽癌是常见的恶性肿瘤，具有明显的区域分布特征[1]。我国是鼻咽癌的高发地区，发病率明显高于世界平均水平[2]。因此，提高鼻咽癌早期筛查水平具有重要的意义。研究表明，长链非编码RNA(long non-coding RNA，LncRNA)是肿瘤潜在的标志物和治疗靶点，其异常表达与肿瘤进展密切相关[3]。结直肠肿瘤差异表达基因(colon rectal neoplasia differentially expressed，CRNDE)是近年来发现的LncRNA家族成员，其在非小细胞肺癌、结直肠癌、胃癌等多种肿瘤中呈高表达[4]，发挥类似促癌基因的作用。但CRNDE在鼻咽癌中的表达及其临床意义尚不明确。本研究拟选取鼻咽癌患者作为研究对象，探讨血清和组织中CRNDE的表达与鼻咽癌患者临床病理参数的关系以及CRNDE促进鼻咽癌细胞增殖情况，以期为实现鼻咽癌早期筛查提供实验依据。

1 资料与方法

1.1研究对象 选取2017年12月至2019年11月在右江民族医学院附属医院住院的鼻咽癌患者78例，其中男51例，女27例，年龄(50.3±7.6)岁。纳入标准：(1)均经临床病理穿刺确诊为鼻咽癌低分化鳞癌；(2)入组前未接受放化疗；(3)年龄≥18岁。排除标准：(1)合并其他恶性肿瘤；(2)合并神经系统疾病等其他已知的可影响CRNDE表达的疾病；(3)患心、肝、肾等脏器功能障碍。TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期30例，Ⅲ～Ⅳ期48例。选取同期于体检中心体检健康者78例作为健康人对照组，其中男48例，女30例，年龄(51.0±7.9)岁。两组性别、年龄比较差异无统计学意义(χ2=90.35，P>0.05)。本研究经右江民族医学院附属医院医学伦理委员会批准(No.YJFY-L-2019056)，各研究对象均知情同意。

1.2标本采集 采集鼻咽癌患者就诊时(未经临床治疗)以及体检健康者体检时的清晨空腹静脉血标本3 mL，3 000×g离心10 min，肝素抗凝剂处理，分离血清，置于-70 ℃保存。同时采集鼻咽癌患者癌组织及配对的癌旁组织(距离癌组织大于5 cm，且经病理组织学证实无癌细胞)标本，送病理科进行免疫组化染色检测，置于-70 ℃保存。

1.3细胞系、主要仪器及试剂 鼻咽癌细胞系CNE-2Z(WT)、CNE-2Z(Cas9-CRNDE)购自上海斯信生物科技公司。mirVana PARIS试剂盒(美国Thermo Fisher Scientific公司)；逆转录试剂盒、CCK8试剂盒(日本TaKaRa公司)；SYBR PrimeScriptTMRT-PCR试剂盒(大连宝生物公司)。ABI 7500荧光定量PCR仪(美国Applied Biosystems公司)；UL2000超微量分光光度计、NanoDrop2000核酸浓度检测仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)。

1.4CRNDE检测

1.4.1RNA提取及逆转录反应 按照mirVana PARIS试剂盒说明书提取各研究对象的血清总RNA；组织标本先进行组织研磨，再按照上述方法进行组织总RNA提取。UL2000超微量分光光度计检测RNA的浓度和纯度，取吸光度(A260/280 nm)为1.8～2.0的样本，按照逆转录试剂盒说明书将RNA逆转录为cDNA，样本置于-20 ℃保存。

1.4.2实时荧光定量PCR(qRT-PCR) 根据GenBank中CRNDE及GAPDH的序列号(分别为NM_001308963和NM_001115114)，由上海生工公司采用DNAClub引物设计软件设计并合成引物。CRNDE上游引物序列：5′-GCGGAGGTTAAGTGT-3′，下游引物序列：5′-AACAGGTTTACCTCCTTATCTTCA

GAA-3′，退火温度55 ℃，产物片段大小841 bp；GAPDH上游引物序列：5′-TGGCTTGGTGTCTTTCTTT

TCT-3′，下游引物序列：5′-GTGGCTGACAAGACTTA

ACTCAA-3′，退火温度52 ℃，产物片段大小1 329 bp。以cDNA为模板，GAPDH为内参照，按照SYBR PrimeScriptTMRT-PCR试剂盒及ABI 7500荧光定量PCR仪说明书进行qRT-PCR检测。PCR反应体系为10 μL，包括:primeSTAY 1 μL，2.5×dNTP MIX 4 μL，10 μmol/L上、下游引物各1 μL，RNase-free H2O 2 μL，cDNA样本1 μL。循环参数：95 ℃预变性30 s；95 ℃ 5 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 5 s，共40个循环；4 ℃延伸10 min。使用StepOneTM软件采集荧光信号并进行熔解曲线分析，CRNDE表达量用2-△△Ct法计算。ΔΔCt=(实验组Ct目的基因-实验组Ct内参基因)-(对照组Ct目的基因-对照组Ct内参基因)。每组设3个复孔，实验重复3次。

1.5细胞培养 取鼻咽癌细胞系CNE-2Z(WT)和CNE-2Z(Cas9-CRNDE)，加入10% RPMI-1640培养基，置于5%CO2、37 ℃恒温培养箱中常规培养。隔日进行传代培养，将细胞调至状态最佳时，接种于96孔细胞培养板进行常规培养，用于后续试验。

1.6CCK-8增殖试验 分别收集实验组[CNE-2Z(Cas9-CRNDE)]及相应的阴性对照组[CNE-2Z(WT)]培养48 h后的细胞，制成单细胞悬液，RPMI-1640培养基调整细胞密度至6×104/mL，接种于96孔细胞培养板，每组设置6个复孔。将细胞置于37 ℃、5%CO2恒温培养箱中培养，于转染72 h后(根据前期预实验选取的最佳时间点)，每孔加入100 μL混合液(CCK-8溶液与RPMI-1640培养基按1∶10体积比配制)，置于37 ℃、5%CO2恒温培养箱中温育3 h，酶联仪检测450 nm波长处各孔吸光度(A)值，取其均值进行计算。实验重复3次。

2 结果

2.1血清及组织中CRNDE表达的差异 鼻咽癌患者血清CRNDE的表达水平(5.27±0.89)明显高于健康人群(1.01±0.12)，差异具有统计学意义(t=18.245,P<0.05)。鼻咽癌患者癌组织中CRNDE的表达水平(1.82±0.21)明显低于癌旁组织(4.56±0.38)，差异有统计学意义(t=3.056,P<0.05)。

2.2血清CRNDE表达与鼻咽癌患者临床病理参数的关系CRNDE表达与鼻咽癌患者性别、年龄无关(P>0.05)；而与T分期、N分期、TNM分期、淋巴结转移、侵犯颈动脉鞘、侵犯颅底与否有关(P<0.05)，见表1。

表1 血清CRNDE表达与鼻咽癌患者临床病理参数的关系

2.3敲除CRNDE对鼻咽癌细胞增殖的影响 CCK-8增殖试验结果显示，转染72 h后转染组与其阴性对照组的细胞增殖能力比较，差异有统计学意义(2.42±0.13 vs 5.81±0.48,t=3.142,P<0.05)。

2.4血清CRNDE在鼻咽癌早期筛查中的临床价值 以30例Ⅰ～Ⅱ期鼻咽癌患者作为实验组，78例体检健康者作为对照组，ROC曲线分析血清CRNDE筛查早期鼻咽癌的临床价值，结果表明，其ROC曲线下面积(AUCROC)为0.835(95%CI：0.598～0.984)，当cut-off值为11.25时，敏感性和特异性分别为93.1%和81.7%，见图1。

图1 血清CRNDE筛查早期鼻咽癌的ROC曲线分析

3 讨论

CRNDE最初被发现于结直肠癌组织中，被认为是结直肠癌差异表达的LncRNA，随后发现在多种恶性肿瘤中也异常表达。Yang等[5]研究发现，CRNDE在宫颈癌组织和细胞系中均表达上调，其高表达与FIGO分期及淋巴结转移呈正相关，且CRNDE高表达者的总生存率明显降低。这与本研究结果较为一致。Cheng等[6]研究结果表明，膀胱癌组织中CRNDE的表达较癌旁组织显著升高，且其表达水平与TNM分期呈正相关；其进一步研究证实，转染CRNDE后可明显提高膀胱癌细胞的迁移和增殖能力，并抑制细胞凋亡。本研究采用CCK8增殖试验也发现了类似的结果，进一步证实CRNDE具有促癌基因的作用。此外，本研究通过对比鼻咽癌患者及健康人群血清CRNDE的表达差异，发现鼻咽癌患者血清中CRNDE的表达水平均显著高于健康人群(P<0.05)，与CRNDE在结直肠癌等肿瘤中的表达情况相类似[7]，这表明CRNDE高表达可能是诱发鼻咽癌的主要因素之一。本研究进一步分析血清CRNDE表达与鼻咽癌患者临床病理参数的相关性，结果发现TNM分期越高者，其血清CRNDE的表达水平越高(P<0.05)，表明CRNDE可能具有促鼻咽癌作用[8]；此外，合并淋巴结转移、侵犯颈动脉鞘及侵犯颅底者的血清CRNDE表达水平明显高于未合并者(P<0.05)，提示CRNDE可以促进鼻咽癌侵袭及迁移[9]。而不同性别、年龄的鼻咽癌患者血清CRNDE的表达水平差异无统计学意义(P>0.05)，提示血清CRNDE不易受鼻咽癌患者个体因素的影响。另外，本研究选取了鼻咽癌患者癌组织和配对的癌旁组织进行CRNDE表达水平的对比，发现癌组织中CRNDE的表达水平较癌旁组织明显升高(P<0.05)，这与血清学实验结果相一致。为了进一步探索CRNDE对于鼻咽癌细胞系的作用，我们选取鼻咽癌细胞[CNE-2Z(WT)]及其敲除CRNDE基因的细胞系 [CNE-2Z(Cas9-CRNDE)]进行CCK8增殖试验分析，结果发现敲除CRNDE基因的鼻咽癌细胞系的细胞增殖能力明显降低(P<0.05)，证实了CRNDE基因可以促进鼻咽癌细胞的增殖。本研究利用ROC曲线分析血清CRNDE对早期鼻咽癌筛查的效能，结果表明其AUCROC为0.835(95%CI：0.598～0.984)，敏感性和特异性分别为93.1%和81.7%，提示血清CRNDE在鼻咽癌早期筛查方面具有良好的临床应用价值。然而，本研究所纳入病例的随访时间较短，且尚未分析CRNDE与鼻咽癌预后的关系，是本实验的不足之处。