植物抗病基因的DNA改组在遗传学实验教学中的应用

张远莉， 庞延军

(南京大学 生命科学学院， 南京 210093)

遗传学是生命科学、医学、农学等相关领域的核心课程，是一门理论与实践相结合的课程，遗传学实验是遗传学课程教学的重要组成部分[1-4]。遗传学实验教学不仅要完成传统的以验证性和示范性实验为主的课程，还需要培养学生严谨的科研思维，提高主观能动性[5-8]。因此我们在遗传学实验的教学中紧密结合科学研究，设计一些综合性实验，将科研成果引入课堂，培养具有创造力的科研人才。

本次综合性实验选择对植物抗病基因Pib的片段进行人工合成与进化，指导学生从不同的水稻品种中克隆出抗病基因的片段，利用现存的自然变异，采用DNA改组(DNA shuffling)技术进行重组，人工进化得到新的基因片段。DNA 改组是目前最常用的人工合成与进化基因的技术之一，它是由Stemmer于1994年首次提出并在美国Affymax研究所的实验室取得成功[9-10]，也称为有性PCR(sexual PCR)、分子育种(Molecular Breeding)。DNA改组主要包括以下几步：1)模板准备。单个基因或一组同源基因为模板。2)酶切：用化学方法(如脱氧核糖核酸酶I：DNaseI酶切)或物理方法(如超声破碎法)将基因切割成一系列随机大小的小片段。3)无引物PCR。这些DNA小片段间具有一定同源性，可互为引物，在不加引物的情况下通过PCR法将小片段组装成大片段。4)有引物PCR。以无引物PCR产物为模板，稀释后，加入合适的引物将大片段相连，得到一个重组基因文库。5)筛选和测序。将此基因文库导入合适质粒，筛选、测序重组子基因。也可将得到的重组子基因，与初始的同源基因混合在一起，作为第二轮DNA改组的模板，重复上述步骤，直至得到所需的突变基因。DNA 改组技术是一项全新的体外人工进化模式，是迄今为止所建立的最有效的分子进化技术。

通过本次综合实验，可以让学生了解分子遗传学的基本操作，从分子水平揭示遗传学的基本现象与规律，并通过综合性、设计性实验，培养学生初步独立进行科学研究的能力和创新能力，为创新型人才培养提供平台。

1 实验方案

1.1 学生分组与实验材料

每班学生约30人，每组4人左右。实验仪器有微量移液器、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、离心机、摇床、培养箱、灭菌锅等。实验试剂：Taq酶、连接酶、PCR相关试剂购自大连宝生物公司；DNaseⅠ 购自Sigma公司；质粒提取试剂盒、PCR纯化试剂盒、凝胶回收试剂盒购自Axygen公司。

实验材料：提供30～40个水稻品种。每组同学合作完成本实验的所有工作。

1.2 实验方案安排

学生首先以提供的水稻品种为模板，PCR扩增得到基因片段(Pib基因)，连入T载体后进行测序，得到亲本的基因序列。然后在教师和助教的指导下对测序出的序列进行分析，挑选合适的基因片段作为下一步人工进化的亲本。

将各自选取的亲本DNA，各取约2 μg混匀，加入DNaseⅠ 15 ℃消化30 min。消化反应结束后，首先80 ℃变性5 min，灭活DNaseⅠ。然后用2%琼脂糖凝胶进行电泳，在紫外灯下割取50～100 bp的片段，进行DNA片段的回收。

在PCR反应体系中加入DNaseⅠ消化产物，在不加入引物的条件下进行PCR反应，让断裂的片段之间互为引物和模板，进行配对和延伸。

无引物PCR反应结束以后，需要特异性的扩增出重组的目的片段，将无引物PCR产物纯化后，稀释1000倍作为模板进行有引物PCR反应(引物序列与产物长度如表1所示)。有引物PCR反应结束后将得到与亲本DNA条带一样大小的目的条带。

对PCR产物进行纯化，与T载体连接，提取质粒，进行序列的测定和实验结果分析。

表1 实验中引物序列与产物长度

2 实验过程

2.1 实验亲本选择

要合成某种基因，首先要了解该基因的遗传资源变异状况。因此，对用于合成目标基因的材料首先进行品种间的遗传多态性分析(MEGA软件：Molecular evolutionary genetics analysis)。给学生提供30～40个材料，让学生分别对这些基因进行克隆和测序；汇总后通过对序列的分析，挑选合适的基因作为下一步人工进化的亲本。指导学生根据不同实验目的来选择人工进化的亲本，选择的亲本数量和品种都由自己决定，学习自主选择和设计实验。表2是其中一组学生选择的用于基因重组的7个亲本，它们的平均核苷酸差异度(Pi，Nucleotide diversity)是0.096。

表2 7个亲本基因的核苷酸差异度

2.2 酶切与重组基因文库合成

DNA 改组是一项操作性很强的技术，这种技术受很多因素的影响，包括DNaseⅠ酶切片段大小，亲本DNA序列的差异度和有性PCR，这些因素都将影响DNA改组的结果。其中亲本DNA片段的酶切效果影响最大，因为亲本DNA酶切的好坏将直接影响改组的效果，酶切后的片段要求均一性比较好，这样可以避免某一亲本片段的过于密集。片段大小的选择也十分重要，一般情况下它与改组的基因片段大小有密切的关系。改组的片段长度小于1 kb，则适宜选择100 bp以下的片段，1～2 kb则适合选择100～200 bp的片段，片段的大小将直接影响重组体的规模和序列差异的大小。若选择太小的片段，则重聚比较困难；选择太大的片段，则重组的效果较差。在实验中，我们的目的片段是1500 bp左右。综合以上考虑，学生们最后选择了100 bp左右的片段。在具体实验中，学生们体验了自己设计和优化实验的过程，有些实验条件需要自己多次摸索才能获得比较理想的结果(图1)。虽然实验过程繁琐，但是学生们的兴趣很大，都希望通过自己的努力获得实验的成功。

M：DL2000 Marker

图1DNA改组步骤

Figure 1 Procedure of DNA shuffling

2.3 重组基因测序结果分析

重组后的基因片段纯化后，与Promega T载体进行连接，转化以后得到了1000多个重组克隆，挑选部分重组克隆进行序列测定。然后指导学生利用生物信息学软件(MEGA软件：Molecular evolutionary genetics analysis)对序列进行分析，部分结果如图2和图3所示。测定的所有序列之中没有任何两个一样的序列，说明重组后的群体较大，变异十分丰富，也间接地说明了DNA改组后亲本序列的交换和重组比较频繁。核苷酸比较分析发现，变异大多数来源于亲本DNA之间的重组和交换，而且交换的频率较大，也有小部分变异来源于随机突变，如图2中红色圆圈标注部分。重组后的平均核苷酸差异度达到了9.3%，与亲本基因间的核苷酸差异度基本一致。把重组后的序列与7个亲本序列进行进化树构建(邻接法NJ：Neighbor-Joining)，显示重组后的序列分布在不同的分枝上(图3)，但还是可以看出基本是平均分布在亲本序列的周围，说明这些序列的变异主要还是来自于亲本序列片段间的交换，随机突变的贡献不是很大。

图2 重组基因的核苷酸序列比对

图3 重组基因的系统进化树Figure 3 Phylogenetic tree of DNA shuffling genes

3 总结

在高等教育阶段，教学和科研是相辅相成的。本实验中，指导学生利用基因的DNA 改组技术，进行基因的人工进化，学生分组完成测序得到的200个重组体与亲本DNA序列完全不同，得到了自然界中不存在的序列，观察和了解基因的人工进化。传统的遗传学实验中，多以验证性实验为主，以掌握实验方法为出发点。本实验的不同之处是一个综合性实验，具有一定生物学意义，通过实验引导学生学习“提出问题、分析问题和解决问题”的方法，较好地激发了学生的学习兴趣。近两年的遗传学实验课程教学评分比以前都有所提高，实验后学生提交的实验感想也提出了对此类综合性实验比较感兴趣。

DNA改组一般是针对某个特定的基因，其主要的优势在于时间短，见效快。1994年，Stemmer用DNA改组技术将细菌对抗生素的抗性提高了32 000倍[10]。通过本实验的学习，学生在分子水平上了解生物的遗传和变异机制，掌握了如PCR、DNA提取、细菌的遗传转化等分子遗传学的相关技术。这样一组综合实验，历时一个月左右，学生不仅掌握了一些分子遗传学的实验方法，而且学习了运用生物信息学分析软件对实验数据进行分析，加强了对理论知识的理解，提高了运用知识的综合能力，同时也为培养学生的科研思维能力奠定了基础。

总之，学生科研思维和创新能力的培养是现代高等教育的重要方向，我们将不断调整实验教学方案，构建完善的实验教学体系，培养高素质的科研人才。