川续断根蛋白提取工艺的优化及分析

晋海军， 蒋廷红， 王海霞， 申旭峰， 于 花， 朱 姗， 张 嘉

(贵州中医药大学实验中心， 贵阳 550025)

川续断(DipsacusasperoidesC. Y. Cheng et T. M. Ai)为川续断科川续断属植物，药用部位为干燥根，具有补肝肾、强筋骨、续折伤、止崩漏等功效[1]。但不同产地的川续断受不同生态因子影响，导致其药材质量存在一定差异[2-3]。在不同生长环境下，不同产地中药材细胞里面的基因可能是稳定不变的，但是其蛋白质的表达却在时刻发生改变。因此，蛋白质层面的分析有助于我们对不同产地中药材质量差异形成的机制展开研究[4-5]。进行蛋白质组学研究时，蛋白提取过程易造成样品蛋白损失，需要对蛋白的提取过程进行优化，以获得尽可能多的蛋白[6]。目前，在蛋白组层面对不同产地川续断展开研究的报道较少。本研究拟通过对川续断根蛋白提取工艺的响应面优化及对不同产地间川续断根蛋白的SDS-PAGE电泳条带分析，为今后在蛋白质组层面进一步揭示不同产地川续断质量差异形成的分子机制提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料川续断根采自湖北鹤峰、贵州息烽和云南剑川的川续断种植基地，每产地多点随机取样，各采30株，洗净液氮速冻，-80 ℃保存。

1.2 方法

1.2.1 蛋白提取

取3种不同产地川续断的块根各4.0 g 分别剪碎放入研钵中，不断加入液氮，迅速研磨，待研磨成粉末时，用洁净的小勺将其装入离心管中；加入3倍体积蛋白质提取缓冲液(0.5% SDS，65 mmol/L Tris-HCl pH 6.8， 5% β-巯基乙醇，10%甘油)混匀；离心管置于冰上10 min左右，每2 min震荡1次；置于4 ℃冰箱，浸提1 h；4 ℃，15 000 r/min离心15 min；取上清液，加入3倍体积-20 ℃预冷的10%TCA丙酮溶液，混匀后置于-20 ℃冰箱1 h，使蛋白质沉降；4 ℃，15 000 r/min离心15 min，弃上清液；沉淀先用预冷丙酮洗涤1次，再用预冷80%丙酮洗涤2次；4 ℃，15 000 r/min离心15 min，沉淀于冰上自然挥干丙酮，置于-20 ℃冰箱保存备用。

1.2.2 蛋白含量测定

将上一步制得的1 mg 蛋白干粉加入至200 μL 水化液(2 mol/L硫脲，7 mol/L尿素，4%CHAPS， 65 mmol/L DTT 和0.2% Bio-Lyte)中， 4 ℃摇床裂解4 h；15 000 r/min， 离心10 min，上清液即为蛋白样品液。采用 Bradford 法蛋白定量。选用牛血清白蛋白(BSA) 作为标准蛋白，测其在595 nm 处的吸光值，绘制标准曲线，测样品蛋白的吸光度值，计算其蛋白浓度。

1.2.3 蛋白质的SDS-PAGE检测分析

将1.2.2中制备的蛋白样品液分装至离心管(每管含蛋白20 μg)，加两倍上样缓冲液(0.5 mol/L pH 6.8 Tris-HCl 2 mL，甘油2 mL，20% SDS (W/V) 2 mL，0.1% 溴酚蓝0.5 mL，2-β-巯基乙醇1 mL，双蒸水2.5 mL，配制成总体积10 mL pH 8.0的溶液) 20 μL，置沸水中水浴5 min，瞬时离心取上清，进行SDS-PAGE电泳。蛋白电泳、染色和脱色方法采用胡朝敦等[7]的方法。用Image-Pro Plus软件对获得的蛋白电泳条带进行灰度值差异显著性分析(P<0.05)。

1.2.4 蛋白提取工艺的响应面优化

以提取温度、提取时间、pH值和料液比4个因素进行试验，每因素设计3个水平，用Design Expert V8.06 软件的Box-Benhnken 实验方案进行响应面优化(表1)。

2 结果与分析

2.1 不同产地川续断根蛋白质含量

以Tris-HCl法提取不同产地川续断根蛋白。由表2可知，湖北产的川续断根中蛋白含量较高，贵州次之，云南较低。

表1 Box-Benhnken试验因素水平

表2 不同产地川续断根蛋白含量

1：云南产川续断；2：湖北产川续断；3：贵州产川续断(图中箭头指示处为筛选的差异蛋白条带)

图1不同产地川续断根蛋白SDS-PAGE图

Figure 1 SDS-PAGE ofDipsacuasperidesroot protein from different habitats

2.2 不同产地川续断根蛋白的SDS-PAGE检测分析

由图1可知，川续断根蛋白的分子量大致分布在15～65 ku之间，不同产地川续断根蛋白条带分布有一定差异。经Image-Pro Plus软件的灰度值差异分析(表3)，发现在24 ku和34 ku处有两条显著差异蛋白条带(P<0.05，图1)，24 ku处不同产地间蛋白表达灰度值为：湖北>云南>贵州，34 ku处不同产地间蛋白表达灰度值为：云南>湖北>贵州，可能这两处的差异蛋白与不同产地间川续断药材质量差异的形成有关。

表3 差异蛋白灰度值

注：差异显著性分析取 α=0.05水平，同一列中含不同字母者为差异显著

2.3 川续断根蛋白提取工艺的响应面优化

2.3.1 响应面试验设计及结果

目前，尚无川续断根蛋白提取工艺的相关报道。研究依据Box-Benhnken实验原理对Tris-HCl法提取川续断根蛋白的工艺进行响应面优化，考察提取温度、提取时间、pH值和料液比四因素对蛋白质定量的吸光度值(OD值)的影响，响应值为蛋白质定量的吸光度值(OD值)，试验方法为四因素三水平的响应面分析法，24个分析因子(1-24)，3个中心试验点(25-27)，共有27个试验点(表4)。

2.3.2 响应面试验模型的建立与显著性检验

利用Design Expert V 8.0.6 软件对表4的数据回归拟合以蛋白含量检测的OD值为响应值，提取温度(A)、提取时间(B)、pH值(C)及料液比(D)为自变量，建立回归方程：

OD值=1.68+0.4A-0.05B+8.742×10-3C-0.15D-0.028AB+0.16AC-0.14AD+4.05×10-3BC-0.13BD-0.056CD-0.80A2-0.09B2-0.28C2-0.25D2

对二次回归方程预测模型进行显著性检验，结果见表5。该模型的显著性水平P<0.0001，说明此模型高度显著；R2=0.9607，且失拟项不显著(P=0.0686>0.05)，说明此模型与实际试验拟合较好。因此，该二次回归方程预测的模型具备较高的可信度与拟合度，可用该方程代替实验真实点对实验的结果展开预测与分析。结果还表明，A、D、A2、C2、D2对蛋白含量OD值的影响高度显著，各因素的交互作用均不显著，所以实验中不同因素对OD值的影响并非简单线性关系。各因素对蛋白含量OD值的影响因素大小为：提取温度>料液比>提取时间>pH值。

表4 Box-Benhnken 试验设计与结果

表5 二次回归方程模型的方差分析

注：“**”高度显著差异，P<0.01；“*”显著差异，P<0.05

2.3.3 响应面分析

响应面的等高线图和曲面图可直观反映两个影响因素的交互作用对响应值的影响，等高线图越近椭圆形则两因素交互作用对OD值的影响越显著。由图2可知，两因素交互作用对蛋白含量OD值的影响大小依次为：提取温度与pH值、提取温度与料液比、料液比与提取时间、料液比与pH值、提取温度与提取时间、pH值与提取时间。

2.3.4 验证性实验

经对回归方程预测模型计算得出川续断根蛋白提取的最佳工艺参数：提取温度16.84 ℃，提取时间0.84 h，pH值6.58，料液比1∶1.64。此最佳条件下预测出的OD值预测值为1.7156。此最佳提取条件下提取蛋白，测量OD值，重复3次，蛋白提取的平均OD值为1.7075(表6)，此OD值与预测值间的相对误差为0.47%，说明此响应面优化实验得出的最佳蛋白提取条件准确可靠。

图2 两因素交互作用的响应面和等高线图

3 讨论与结论

目前，有关不同产地川续断质量差异的报道较多，但大多集中在生理、药理及核酸层面[8-10]，尚无在蛋白组层面揭示不同产地质量差异的报道。

表6 验证实验

本研究运用紫外分光光度法，对不同产区的川续断进行蛋白定量及SDS-PAGE分析。结果显示，湖北产的川续断根中蛋白含量较高，贵州次之，云南较低；经SDS-PAGE分析，不同产地川续断根蛋白条带分布存在一定差异，在24 ku和34 ku处有两条较明显的差异蛋白条带在云南及湖北产的川续断根蛋白中有表达，而在贵州产的川续断根蛋白中则没有表达，34 ku处的蛋白条带在云南产川续断根中表达量远高于湖北，可能这两处的差异蛋白与不同产地间川续断药材质量差异的形成有关，34 ku处的差异蛋白条带可作为鉴别湖北、云南、贵州不同产地川续断的特征蛋白条带。李晓琳等[11]用SDS-PAGE方法揭示出不同产地刺五加种子蛋白电泳图谱具有一定种内差异。俞乐等[12]经蛋白电泳分析，指出不同产地芡实在45.0～66.2 ku处均有一条明显的蛋白谱带。张延红等[13]的甘草种子蛋白提取及SDS-PAGE电泳技术研究发现乌拉尔甘草和胀果甘草种子间存在差异蛋白质条带。因而，可通过蛋白电泳技术，在蛋白组层面寻找同一物种在不同产地间的差异，也可将此差异作为不同产地间物种鉴定的依据。

本研究首次利用响应面优化法得到了川续断根蛋白最佳的提取工艺条件：提取温度16.84 ℃，提取时间0.84 h，pH值6.58，料液比1∶1.64。