pH值和DO对UVA-LED光降解氧氟沙星的影响：动力学、机理及路径
2020-06-15姚娟娟甘敬业夏彬
姚娟娟，甘敬业，夏彬
(1. 重庆大学 环境与生态学院；三峡库区生态环境教育部重点实验室，重庆 400045； 2.重庆市市政设计研究院，重庆 400020)
氧氟沙星(C18H20FN3O4)是一种应用最广泛的氟喹诺酮类抗生素之一，主要作用于人类和动物的细菌感染，特别是在畜禽饲养和水产养殖等领域使用量巨大，主要通过生产及使用过程进入水环境[1-3]。由于它抵抗水解、热分解和生物降解，传统的水处理工艺很难将其完全去除[4-5]。近年来，世界范围内水环境中残留的氧氟沙星检出率高，其浓度范围为ng/L到μg/L，遍及地表水、地下水等多种水体，且在市政污水处理厂出水和医院废水中检出含量分别高达5 700 ng/L和35 500 ng/L[6-9]。氧氟沙星等抗生素不断进入生态环境，将会导致生物毒性和抗性基因的产生，从而引起环境风险和生态风险[10-11]。
氧氟沙星具有光敏性，在水溶液中的光降解反应遵循一级反应动力学，并通过不同的途径导致许多产物的形成[12-13]。它含有羧基基团和胺基基团，是典型的两性离子化合物，随着环境pH值的改变，其化学形态会改变，光降解行为则可能会发生显著变化，探究pH值对氧氟沙星光降解过程的影响十分重要[14-15]。在自然环境中，直接、间接和自敏化光降解为其主要降解途径[16-17]。自然水体中，复杂的基质主要影响其间接光降解，如天然水中的金属阳离子(Ca2+/Fe3+)和NO3-分别通过配位作用和光致生成·OH促进氧氟沙星的光降解；溶解性有机物可作为光敏剂吸收光产生氧活性物质(Reactive oxygen species，ROSs)从而间接降解氧氟沙星，也可能与氧氟沙星竞争吸收光从而抑制光降解[18-19]。与此同时，氧氟沙星在紫外光照射下会进行光化学转化产生ROSs，从而发生自敏化光降解[20-21]，可见，水体中是否存在溶解氧(Dissolved oxygen，DO)会直接影响光降解过程。然而，自敏化光降解在氧氟沙星光降解过程中的影响尚未引起重视，pH值和DO对光降解过程的影响及其作用机制尚未明晰，特别是对降解产物和路径的影响目前仍鲜有报道。
笔者通过在不同pH值和DO条件下的超纯水中UVA(365 nm)光降解氧氟沙星，并对其降解产物进行检测分析，以探究pH值和DO对氧氟沙星光降解过程、机理和路径的影响机制，以期进一步认识氧氟沙星的化学形态和自敏化光降解对降解过程的影响。
1 材料与方法
1.1 试剂与仪器
试剂：氧氟沙星(OFX，99.4%)购于德国Dr.E公司；乙腈(C2H3N，HPLC)、甲酸(CH2O2，HPLC)、磷酸(H3PO4，AR)和三乙胺(C6H15N，AR)购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；盐酸(HCl，GR)和氢氧化钠(NaOH，GR)购于国药集团化学试剂有限公司；高纯氮气(N2)购于重庆嘉润气体有限公司。试验用溶液均用Master-S净水系统净化的去离子水配备。
仪器：考虑到UVA-LED体积小、节能率高、不含汞、使用寿命长等因素，使用UVA-LED代替传统低压汞灯作为紫外光光源。UVA-LED阵列，由9个单片UVA-LED组成，单片功率9 W，发射波长365 nm(深圳市赛特紫外技术有限公司)；pH计(MM340，美国HACH)；溶解氧仪(Multi 3410，德国WTW)。
1.2 试验方法
直接光降解试验在长方体石英反应器(40 mm × 40 mm × 60 mm)中进行，反应溶液体积为70 mL，光源为UVA-LED阵列，光照强度为80 mW/cm2，控制反应温度为20±1 ℃。pH值用1 mol/L的HCl或NaOH溶液调节，DO浓度用曝高纯氮气(N2)或空气(Air)来调节，每次试验提前在黑暗中曝气至少30 min。辐照时间为60 min，分别在0、5、10、15、20、30、40、50、60 min取样进行HPLC或HPLC-MS检测分析。降解动力学和光学分析试验中，氧氟沙星初始浓度为1.0 mg/L，降解产物分析试验中氧氟沙星初始浓度为10.0 mg/L，高浓度的氧氟沙星在反应过程中会产生足够数量的中间体，有助于提高检测结果的准确性。所有试验均进行3次，每个数据点代表平均值，标准差小于10%。
1.3 分析方法
1.3.1 定量分析 氧氟沙星的定量分析采用高效液相色谱法(HPLC)。Hitachi 5100高效液相色谱仪，配备Agilent C18 色谱柱(150 mm × 2.1 mm，5 μm)，流动相为乙腈∶0.05 mol/L磷酸溶液(三乙胺调pH值至2.6)=15∶85，流速为0.50 mL/min，进样量20.0 μL，柱温为30.0 ℃，紫外检测器检测波长为290 nm。氧氟沙星标准曲线R2=0.999 6，定量限为0.007 8 mg/L，检测限为0.002 3 mg/L。
1.3.2 定性分析 氧氟沙星及其降解产物定性分析采用高效液相色谱-质谱联用法(LC/MS)。使用SHIMADZU LC 30A- AB SCIEX Triple TOF 4600液质联用仪，液相色谱条件为：Agilent C18(100.0 mm×2.0 mm，2.2 μm)色谱柱，流速为300 μL/min，温度为40 ℃，流动相为用0.1%甲酸酸化的乙腈(A)和超纯水(B)，采用梯度洗脱模式，洗脱程序为：以10% A为初始条件，等量洗脱2 min，随后在5 min内将A提高到90% A，之后以该流动相组成维持2 min，最后在2 min内回到初始条件；质谱条件为：采用ESI+模式，扫描100～1 000 Da，离子喷雾电压(IS)为5 500 V，去簇电压(DP)为80 V，干燥气压(CUR)保持30 kPa，离子源气压保持55 kPa，离子源温度保持550 ℃。
1.3.3 光学分析 用紫外-可见光分光光度计(PhotoLab 6600，德国WTW)对氧氟沙星溶液进行全波长扫描，石英比色皿光程为10 mm，波长范围为200～400 nm；用荧光分光光度计(F97，上海棱光技术有限公司)采用二维扫描下的发射模式对氧氟沙星溶液进行扫描，石英比色皿光程为10 mm，发射波长扫描范围为400～800 nm，发射带宽为10 nm，激发波长设定为365 nm，数据模式采用荧光模式。
2 结果与讨论
2.1 降解动力学与机理
2.1.1 pH值的影响 为探究pH 值对氧氟沙星光降解过程的影响，考察了氧氟沙星溶液在DO=9、0 mg/L时不同初始pH值(3、7、11)条件下的光降解过程，并设置对照组(黑暗，pH=7，DO=9 mg/L)，降解效率如图1所示。
从图1中可以看出，UVA(365 nm)光照可以降解氧氟沙星，但其降解效率比较低，这是导致氧氟沙星在自然界中留存时间较长的原因之一。在溶解氧充足和缺乏的条件下(DO=9、0 mg/L)，60 min内不同pH值的氧氟沙星溶液降解效率有差别，如表1所示，均在pH值为7时最高，pH值为11时次之，pH值为3时最低。氧氟沙星的光降解过程服从一级反应动力学模型，拟合结果如图2所示，光降解速率常数如表1所示，由图2和表1可以看出，pH值为7和11的降解速率相似，均比pH值为3快。
图2 不同pH值和DO条件下对氧氟沙星光降解 一级反应动力学拟合Fig.2 Photodegradation first-order kinetics fitting of OFX at different pH and DO
pH值DO/(mg·L-1)k/min-1R2去除率/%0390.0050.980 727.00790.0070.980 033.11190.0060.995 532.70300.0020.991 813.20700.0040.987 520.01100.0030.998 717.4
对不同pH值的氧氟沙星溶液进行光学分析发现，氧氟沙星对UVA(365 nm)有吸收，且伴随着荧光的发射，荧光发射强度随pH值的变化而变化，如图3所示。
图3 不同pH值下氧氟沙星的光学分析Fig.3 Optical analysis spectra of OFX at different pH
从不同pH值氧氟沙星溶液的紫外-可见光吸收光谱(图3(a))可以看出，pH值为3的氧氟沙星吸光度最高，其次是pH值为11时，最后是pH值为7时。但光降解效率和速率却是pH值为3最慢，而pH值为7最高，说明无法用吸光度来解释不同pH值时氧氟沙星降解效果的差异。
在光降解其他结构相似的氟喹诺酮类抗生素的研究中发现，不同化学形态的量子产率差异是其光解效果随pH值变化的主要原因[16,22-23]。氧氟沙星的pKa1、pKa2分别为6.1、8.3[20]。当pH
2.1.2 DO的影响 为探究自敏化光降解在氧氟沙星光降解中的作用，试验在不同pH值条件下，通过改变降解体系中溶解氧浓度(DO=9、0 mg/L)，实现降解过程中的有氧及无氧状态。从图1、图2和表1中可以看出，在不同pH值条件下，有氧时的降解效率及速率均优于无氧时，但无氧时仍有较好的降解效果，说明氧氟沙星在超纯水中主要为直接光降解，自敏化光降解对光降解过程有显著的促进作用。
(2)
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图4 氧氟沙星的光化学转化过程Fig.4 Relevant processes to OFX photochemistry
2.2 降解产物与路径
对氧氟沙星在有氧时不同pH值条件下及无氧时最优pH值条件下60 min内不同时间间隔的光降解产物进行LC/MS分析，一共检测到7种产物，具体情况见表2。DO=9 mg/L条件下，pH值为3时检测到6个产物，pH值为7时检测到7个产物，pH值为11时检测到7个产物；DO=0 mg/L条件下，pH值为7时检测到6个产物。主要降解产物(序号1、序号3、序号4、序号6和序号7)在3种pH值和不同DO条件下都存在。
综合LC/MS分析结果和已有的氟喹诺酮类抗生素光降解路径研究，发现UVA光降解氧氟沙星产物主要经历4个降解路径，如图5所示，分别是：1)脱甲基反应。氧氟沙星侧链哌嗪环上的甲基是一个非常活跃的基团，序号1被认为是哌嗪环N-4’脱甲基生成的[18,26]，序号2可能是哌嗪环N-4’甲基被羟基取代的产物。2)哌嗪环的裂解和氧化反应。氧氟沙星的侧链哌嗪环在光降解过程中容易发生裂解和氧化。序号3被认为是哌嗪环被氧化成醛结构的产物[18,26-27]，序号4和序号5可能是脱哌嗪环和哌嗪环开环的产物。3)羟基化反应。序号6在直接光降解的过程中被认为是羟基化产物，但加成的羟基在氧氟沙星分子中位点具有争议，有研究认为连接在喹诺酮环上[28-29]，还有研究者认为连接在侧链的哌嗪环上[4,27,30]。4)脱羧反应。Zhang等[18]在模拟太阳光降解氧氟沙星中检测到HCOO—，说明氧氟沙星在光照下会产生脱羧反应，在本体系中，序号7可能是喹诺酮环脱羧的产物。
表2 不同试验条件下氧氟沙星光降解产物列表Table 2 Photodegradation products of OFX at different conditions
注：“√”代表检测到该产物；“×”代表没有检测到该产物
图5 氧氟沙星光降解路径Fig.5 Possible photodegradation pathways of OFX
结合表2和图5可以看出，不同pH值和DO条件下的氧氟沙星光降解路径及其产物差别细微，4种降解路径均存在。但观察产物峰面积随时间的变化关系图(图6)可发现，各个产物的生成规律和进一步降解效果都存在差异，且明显受pH值和DO的影响。
2.2.1 pH值的影响 通过分析DO=9 mg/L时不同pH值(pH值为3、7、11)条件下氧氟沙星光降解产物的峰面积与时间的变化关系，如图6所示，从而研究不同pH值对降解产物和路径的影响。
1)脱甲基反应。哌嗪环N-4’甲基的脱除和被羟基取代反应在pH值为11时最易发生，pH值为7时较慢发生，产物随时间累积。但哌嗪环N-4’脱甲基反应在pH值为3时没有发生，可能是由于酸性条件下游离的OH-含量很低，而使得反应难以发生。在pH值为11时，脱甲基产物序号1和序号2会被进一步降解，在pH值为7时则是随时间累积。
2)哌嗪环的氧化和裂解反应。pH值为11时更易发生哌嗪环的氧化反应和脱哌嗪环反应，pH值为7次之，最后是pH值为3。但pH值为11条件下快速产生的序号3和序号4产物会被进一步降解，pH值为7和3则是随时间累积。值得注意的是，pH值为3的哌嗪环开环产物序号5随时间累积，pH值为7和11则是快速产生且进一步被降解，最终pH值为3时的序号5产量远远高出pH值为7、11时，说明阳离子态的氧氟沙星更易发生哌嗪环开环反应，这也是其他结构相似的氟喹诺酮类抗生素阳离子态光解过程中最常见的裂解途径[18]。
3)羟基化反应。该反应在pH值为11时更易发生，pH值为7次之，最后是pH值为3。其产物序号6在pH值为7、11条件下先生成，随后被进一步降解，而pH值为3时则是随时间累积，说明该产物在酸性条件下比较稳定，在中性和碱性条件下比较活泼易进一步参与降解反应。
图6 不同试验条件下氧氟沙星光降解产物的峰面积随 时间的变化关系图Fig.6 The peak area of ofloxacin photodegradation products vary with time under different experimental conditions
4)脱羧反应。该反应在所有pH值条件下都会发生，在产物生成过程中，pH值为7、11时的生成速率相当，都快于pH值为3时的生成速率。其产物都是先迅速生成，随后浓度降低，说明该产物在不同pH值条件下都不稳定，会进一步被降解。
结合图5和图6可以看出，脱甲基反应和哌嗪环的氧化和裂解反应在不同的pH值条件下均是氧氟沙星最主要的降解路径，这两种路径均与哌嗪环有关。值得注意的是，除哌嗪环开环反应主要在pH值为3时发生外，其他反应在pH值为11时最易发生，且反应前期产物生成速率均高于其他pH值。一方面是因为氧氟沙星溶液在pH值为11时荧光强度较弱，如图3所示，可能产生了更多的激发态氧氟沙星，促进了光降解；另一方面可能是由于哌嗪环上N-4’位的孤对电子在阳离子态(pH值为3)时会发生质子化，在阴离子态(pH值为11)游离，提高了氧氟沙星在阴离子态的供电子能力[31]。但pH值为11时，产物均呈先迅速生成随后被进一步降解，一方面可能是由于阴离子态的3OFX*在紫外光照射下会发生质子化，转化成两性离子态甚至阳离子态[32]，这时ROSs和产物的生成均会减少；另一方面则是这些产物可能在碱性条件下不稳定，易被进一步光降解。此外，除序号5在pH值为3时产量最高，其他产物在pH值为7时的最终产量均大于pH值3、11时，这可能是由于pH值为7时直接和自敏化光降解作用稳定，从而促进了产物的稳定生成和累积。
2.2.2 DO的影响 通过分析在pH值为7时，不同溶解氧浓度(DO=9、0 mg/L)条件下氧氟沙星光降解产物的峰面积与时间的变化关系，如图6所示，探究有氧及无氧条件对降解产物和路径的影响。
1)脱甲基反应、哌嗪环的氧化和裂解反应。这是氧氟沙星最主要的两条降解路径，在有氧时均存在；在无氧时，只有哌嗪环开环反应不会发生。可能是因为在有氧时，哌嗪环开环反应主要在pH值为3的条件下发生，pH值为7的条件下微弱反应主要是ROSs攻击的结果，而在无氧时没有氧气可反应产生ROSs，因此，没有发生哌嗪环开环反应。值得注意的是，在无氧时，所有产物均呈现先快速生成随后被进一步降解的趋势；而在有氧时，除序号2在45 min后略有降低外，所有产物均随时间累积，且在无氧时，各产物在生成过程中的生成速率均大于有氧时的生成速率。导致这些现象产生的原因，一方面可能是在无氧条件下，激发态氧氟沙星主要通过直接光降解转化为产物，直接光降解效率较高；另一方面可能是在有氧条件下，氧气会将3OFX*淬灭回基态OFX，从而影响了光降解效率。此外，3OFX*会与氧气反应生成ROSs，虽然消耗了一部分3OFX*，但ROSs的生成促进了自敏化光降解的发生，从而促进了产物的进一步产生。
2)羟基化反应和脱羧反应。这两种途径在有氧和无氧时均存在，其产物均呈先快速生成随后被降解的趋势，但在无氧时，其产物生成过程的生成速率和总体降解效率均低于有氧时。这可能是由于这两种反应在直接光降解过程中不易发生，而在有氧条件下，ROSs的生成加速自敏化光降解的进行，促进了反应的发生。
3 结论
1)氧氟沙星的光降解过程符合一级反应动力学，降解效率及速率在pH值为7的条件下最快，pH值为11时次之，最慢为pH值为3，其化学形态随pH值变化而引起光量子产率的改变是造成光降解效果差异的主要原因，而与吸光度大小无关。
2)氧氟沙星在超纯水中主要为直接光降解，DO存在时，激发态氧氟沙星与O2间有效的能量和电子转移帮助生成了ROSs，形成了自敏化光降解，显著促进了氧氟沙星的光降解。
3)氧氟沙星降解路径主要为脱甲基、哌嗪环的裂解和氧化、羟基化和脱羧基反应。不同pH值和DO条件下的降解路径及其产物差别细微，仅有哌嗪环N-4’甲基被羟基取代反应和哌嗪环的开环反应分别在pH值为3和DO=0 mg/L条件下没有发生。
4)pH值和DO对降解产物的生成和进一步降解随时间的变化有显著影响。pH值为11时更易发生这些反应，产物生成速率快且易被进一步降解，pH值为7和3时产物生成速率较慢但产量随时间累积。DO存在时，产物的生成和降解是直接光降解、自敏化光降解和氧气淬灭3OFX*3个过程共同作用的结果，而在无DO时则主要是直接光降解的作用。
